乌拉草多糖的提取纯化、结构表征及生物活性研究

发布时间：2020-07-24 21:45

【摘要】：乌拉草(Carex meyeriana Kunth)属于莎草科(Cyperaceae)薹草属(Carex)植物,广泛分布于中国东北部,并且具有保暖和改善血液循环的功能,具有较高的研究价值。通过文献检索,目前,乌拉草的研究主要集中在挥发油和黄酮化合物上,乌拉草多糖的研究尚未进行系统的研究。本文以乌拉草为原材料,对乌拉草多糖的提取、纯化、分离、结构表征和生物活性进行了系统的研究,为深度开发乌拉草提供了理论依据。研究方法与主要成果如下:利用响应面法(RSM)对乌拉草多糖的热水提取工艺进行了优化,同时对比微波辅助提取法和超声辅助提取法。热水提多糖(HWEP)、微波提多糖(MAEP)和超声提多糖(UAEP)的初步结构表征采用了高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(FTIR)和紫外分光光度法(UV-Vis)。通过测定DPPH自由基、羟基自由基和ABTS+自由基清除活性来评价三种多糖的抗氧化活性。实验结果表明,热水提取法、微波辅助提取法和超声辅助提取法的多糖提取率分别为0.47±0.01%、0.28±0.02%和0.25±0.02%,热水提取法的提取率最高。HWEP和MAEP均由Rha:Xyl:Arab:Fru:Glu:Gal组成,摩尔比分别为1.05:1.21:3.86:1:3.61:4.5和1:1.95:1.72:1.78:4.36:6.18。UAEP由Rha、Xyl、Arab、Fru、Man、Glu、Gal组成,摩尔比为1:2.31:5.23:1.05:3.17:4.17:7.89。HWEP、MAEP和UAEP的分子量分布分别为16 kDa~1698 kDa、15 kDa~913 kDa和17 kDa~1118 kDa。红外光谱扫描及其二阶导数分析也证明了不同提取方法所得多糖的存在差异。抗氧化活性研究表明,三种方法提取的多糖均具有较高的清除DPPH自由基、羟基自由基和ABTS+自由基的活性,其中HWEP抗氧化活性优于其他两种。因此,HWEP具有较高的研究价值。采用静态吸附试验对比了AB-8、D101、S-8、X-5和NKA-Ⅱ五种大孔树脂对乌拉草多糖的纯化效果,最终筛选出AB-8大孔吸附树脂更适用于纯化乌拉草多糖;利用大孔吸附树脂对HWEP进行纯化,并结合层次分析法(AHP)和响应面优化法(RSM)对乌拉草多糖纯化工艺进行了优化。层次分析的结果显示大孔吸附树脂纯化的多糖回收率、脱蛋白率和脱色率的权重系数分别为0.515、0.372和0.113;多糖纯化的最佳工艺条件为:洗脱体积为2.74 BV,流速为1.88 BV/h,样品浓度为2.10 mg/mL,最大预测综合得分可达64.02%。最佳纯化工艺下多糖回收率、脱蛋白率、脱色率分别为49.63±1.24%、82.06±2.17%和66.43±1.51%。利用阴离子交换DEAE-52纤维素对纯化后的乌拉草多糖进行分离;采用PMP柱前衍生化法、凝胶色谱分析法、UV-Vis和FTIR进行结构表征;以RAW264.7细胞为研究对象,对多糖的免疫调节活性进行了研究。获得了CMKP-1和CMKP-2两个组分的乌拉草多糖;CMKP-1和CMKP-2均由Man、Rib、Rha、GluA、GalA、Glu、Gal、Xyl、Arab和Fuc组成,摩尔比分别为8.93:1:4.62:1.41:1.78:10.7:24.69:4.51:15.92:1.27和7.85:1:5.05:1.99:3.15:12.47:15.41:1.54:6.91:3.15。CMKP-1和CMKP-2的主要分子量分别为22.30 kDa和48.10 kDa。FTIR揭示了CMKP-1和CMKP-2的多糖特征吸收峰。刚果红试验表明,CMKP-1和CMKP-2具有三螺旋构象。免疫调节实验结果显示了在一定浓度范围内,CMKP-1和CMKP-2对RAW264.7细胞均具有较好的免疫调节作用,可作为一种潜在的免疫调节剂。
【学位授予单位】：吉林化工学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ281
【图文】：

曲线,吸光度,曲线,提取温度

图 2.1 葡萄糖标准品吸光度-浓度标准曲线如拟合出的线性方法所得结果显示，葡萄糖标准曲线的线性回归方程为=5.575x+0.0063 R2=0.9992，结果表明葡萄糖在 0.02 ~ 0.1 mg/mL 浓度范围内度和吸光度呈良好的线性关系，该标准曲线可用来计算乌拉草多糖含量。.3.2 多糖提取工艺优化.3.2.1 单因素实验在多糖的提取过程中，液料比、提取时间和提取温度均对多糖的提取率有影响作用。乌拉草多糖的提取率受液料比、提取时间和提取温度这三种影响的影响情况，实验结果如图 2.2 所示。

提取时间,提取温度

图 1.2 液料比（a）、提取时间（b）和提取温度（c）对乌拉草多糖的提取率影如图 2.2（a）所示，液料比对乌拉草多糖提取率的影响。液料比在至 30:1 mL/g 范围内，随着液料比的增加乌拉草多糖的提取率也随之因为提高液料比可以显著增大提取溶剂与粉末样品的接触面积，从而更液料浓度梯度作为动态作用，萃取乌拉草多糖过程中的扩散速率得到了当液料比达到 30:1 mL/g 乌拉草的提取率为 0.43 ± 0.01%达到最大值料比的继续增加，乌拉草多糖提取率反而有下降的趋势。因此，30:1因素试验下，较为适合提取液料比。如图 2.2（b）所示，提取时间对乌拉草多糖提取率的影响。通过固定其

响应面,提取温度,提取时间

20图 2.3 响应面图 3D 图（a、c 和 e）和 2D 轮廓图（b、d 和 f）显示了液固比（X1）、提取时间（X2）、提取温度（X3）对多糖产量的影响如图 2.3（a 和 b）描述了 3D 图和 2D 轮廓图，结果表明提取时间和液料比对多糖提取率的影响是中等的。适当的提取时间和液料比可以提高多糖的产量，而过大的提取时间和液料比会导致提取率下降。液料比和提取温度对多糖提取率的影响分别如图 2.3（c 和 d）所示，随着提取温度和液料比的升高，乌拉草多糖的提取率也会随之增加增加。然而，当提取温度和液料比过高时，乌拉草多糖提

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