刺参肠道源抗菌肽的分离、纯化及抗菌活性研究

发布时间：2020-07-30 15:34

【摘要】：本文以新鲜刺参(Apostichopus japonicas)肠道为原材料,以多肽粗提物得率和抗菌活性为指标,采用甲醇浸提法和乙酸溶液浸提法提取仿刺参肠道中的多肽。选用单因素以及正交实验法优化提取参数,得到浸提参数的最佳值。采用切向流膜包超滤技术制备出4组不同分子量范围的多肽,并检测其对大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的抗菌活性。使用Sephadex G-25柱层析进行分离纯化,并对所得组分抗菌活性进行检测,最后使用高效液相色谱仪(HPLC)对所得具有抗菌活性的多肽进行分析。实验结果如下:1.刺参肠道抗菌肽的提取方法和工艺条件的优化以粗提物得率为指标,采用单因素和正交试验对甲醇和乙酸浸提法进行优化,所得最佳提取条件,甲醇浸提法为:料液比0.3 g/mL、浸提液浓度80%、浸提时间24h、离心转速8000 r/min,正交所能取得的最高得率为8.33%。乙酸浸提法为:料液比0.2 g/mL、浸提液浓度7%、浸提时间24 h、离心转速8000 r/min。正交所能取得的最高得率为7.41%。粗提物多肽含量测定结果:甲醇组为3.26 mg/mL,乙酸组为2.62 mg/mL。2.粗提物超滤结果分析及抗菌活性的测定采用切向流超滤系统将甲醇和乙酸粗提物分别分成4个分子量多肽组,分别为:1kD、1~3kD、3~5kD、5~10kD,发现3kD以上组需通过4次超滤方可将不同分子量大小的多肽分开,3kD以下组则需要至少5次超滤才能将不同分子量的多肽分开。采用比浊法测试甲醇和乙酸超滤组不同分子量组的多肽对7种细菌的抑菌活性,绘制各个细菌24 h的生长曲线,得到各分子量组多肽的抗菌活性。结果表明:小于1kD的甲醇超滤组多肽在甲醇和乙酸各分子量超滤多肽组中的抑菌谱最广,抗菌活性最强。3.葡聚糖凝胶G-25层析纯化分析及抗菌活性测定对超滤后抗菌活性最强样品组进行Sephadex G-25层析纯化,经洗脱得到3种成分,分别记为P1、P2、P3。对得到的3种洗脱成分使用抑菌圈法和比浊法进行抗菌活性的测定,结果表明:P2对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、副溶血弧菌和鳗弧菌的抑菌圈直径为16.5 mm、15.7 mm、14.6 mm、13.9 mm、15.1mm,最低抑菌浓度(MIC)为1000μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、3000μg/mL、2000μg/mL,P1与P3无抗菌活性。同时,分析了加热时长、加热温度及冻融次数对P2抗菌活性的影响,结果显示:加热时长及温度对P2影响不显著,冻融次数对P2影响显著;Tricine-SDS-PAGE电泳结果显示:P2在分离胶上为单一条带,分子量为4.5kD;最后通过HPLC对P2成分进行分析,结果显示P2由5种物质构成。
【学位授予单位】：烟台大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ914.2
【图文】：

模型图,抑菌机理,抗菌肽,模型

7图 1-1 抗菌肽抑菌机理模型[70]Fig.1-1 Antibacterial mechanism of antimicrobial peptide1.4 抗菌肽纯化方法研究目前，国内外分离、纯化海洋生物活性肽方法主要有切向流超滤技术、层析技术、电泳技术等。根据层析柱中填料和样品在通过填料时分配、交换的原理不同，层析方法包括凝胶层析、亲和层析、疏水层析和离子交换层析等[71,72]。层析时所用填料主要有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和硅胶颗粒等。

路线图,路线

本研究的技术路线

层析分离

将样品通过 0.22μm 水相滤膜过滤，去除杂质，防止堵塞色谱柱；分别配制流动相 A：0.1%三氟乙酸（TFA）和流动相 B：乙腈，并分别通过 0.22 μm 水相滤膜和有机滤膜除杂，并使用超声波清洗器对流动相进行脱气处理，防止其中的气泡对结果产生影响。2）色谱柱首先通过 A 液进行平衡，待基线稳定后，用微量注射器进样 20 μL，0-10min，B 液从 0-30%，10-30 min，B 液从 30%-90%，控制流速 1 mL/min，柱温 35 ℃，检测波长为 214 nm。待洗脱完毕后，将导出结果并分析。4.3 结果分析4.3.1 Sephadex G-25 层析分离纯化结果分析将分子量＜1kD 的多肽配制成 25 mg/mL 的溶液，过 0.22 μm 滤膜，离心上样。使用 0.5%甲醇做洗脱剂，洗脱流速为 0.5 mL/min，每 6 min 收集一管，观察图 4-1洗脱分离结果：共收集到 50 管洗脱液，经 280 nm 下紫外检测后出现 3 个洗脱峰，分别记为 P1、P2 和 P3。下一步，对所得三种组分进行抗菌活性的测定。

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