不同采摘时期山刺玫叶总黄酮的提取纯化及其生理活性研究

发布时间：2020-07-30 16:35

【摘要】：山刺玫(Rosa davurica Pall.)是蔷薇科蔷薇属纯天然植物,广泛生长于我国东北地区的山区和丘陵地带,其活性成分主要包括黄酮类、三萜类和人体必需氨基酸等。现代药理学研究表明山刺玫具有抗氧化、抗衰老、免疫增强等功效,具有极高的药用价值。近年来大部分研究报道主要集中在山刺玫的果实上,而对于山刺玫叶的研究报道较少。所以,本研究以山刺玫叶中总黄酮为研究对象,在此基础上,首次从抗氧化、免疫增强和抗衰老机制方面研究山刺玫叶总黄酮的生理作用。利用醇提法结合正交试验法对山刺玫叶总黄酮的提取工艺进行优化,并利用D101大孔树脂进行总黄酮的纯化。在此基础上,测定不同采摘季节山刺玫叶总黄酮含量变化。山刺玫叶总黄酮的抗衰老作用,主要在体外抗氧化方面对·DPPH自由基、·OH自由基、O_2~-·自由基、ABTS~+·自由基的清除作用进行检测。在体内抗氧化试验方面建立衰老模型,选取SPF级昆明种小鼠60只,雌雄各半并随机分为空白组、衰老模型组、维生素E组(50 mg/(kg·d))和山刺玫叶总黄酮低、中、高剂量组(1.0、2.0、4.0 g/(kg·d)),共6组(n=10),空白组小鼠均用等体积生理盐水灌胃和皮下注射,其余各组小鼠均颈背部皮下注射125 mg/(kg·d)D-半乳糖。6周后分别测定各组小鼠肝脏、血清和脑组织中的SOD、GSH-Px酶活力及MDA含量。其次,从免疫增强方面检测各组小鼠免疫器官指数;应用ELISA法检测各组小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α;HE染色法观察各组小鼠脑组织的形态学变化;以及对利用ConA诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖情况进行考察,进而探究山刺玫叶总黄酮的免疫增强机制。本试验研究内容及结果如下:1.由单因素分析结合正交实验法确定了山刺玫叶总黄酮最佳提取工艺为:80%乙醇浓度、料液比1:30 g/mL、水浴温度80℃、水浴时间2 h、得率为4.976%;通过对5~9月之间的总黄酮含量测定结果可知:8月中旬的山刺玫叶总黄酮含量最高,可达33.84mg/g;D101大孔树脂纯化条件确定为:上样液浓度为原提取液稀释4倍、吸附速率为2BV/h、上样液pH值为4、解吸液为70%乙醇、洗脱速率为2 BV/h、洗脱液用量为7BV,在此条件下,所得总黄酮的纯度为57.3%。2.山刺玫叶总黄酮的体外抗氧化活性测定试验结果表明:山刺玫叶总黄酮对·DPPH、·OH、O_2~-·和ABTS~+·等四种自由基均具有良好的清除作用,清除率可随样品浓度增加而增大,其抗氧化能力与V_C接近;山刺玫叶总黄酮的体内抗氧化研究表明:与衰老模型组比较,山刺玫叶总黄酮中、高剂量组能显著或极显著提高衰老模型组小鼠肝脏中的SOD酶活力(P0.05,P0.01),同时中、高剂量组也能显著或极显著降低小鼠肝脏中的MDA含量(P0.05,P0.01);山刺玫叶总黄酮中、高剂量组能显著或极显著提高衰老模型组小鼠血清中的SOD、GSH-Px酶活力(P0.05,P0.01),同时中、高剂量组也能显著或极显著降低血清中的MDA含量(P0.05,P0.01);山刺玫叶总黄酮高剂量组能显著提高衰老模型组小鼠脑组织中的GSH-Px酶活力(P0.05),且高剂量组也能显著降低脑组织中的MDA含量(P0.05);维生素E组小鼠肝脏、血清和脑组织中的SOD、GSH-Px酶活力和MDA含量均有极显著差异(P0.01)。3.在免疫增强方面,与衰老模型组比较,山刺玫叶总黄酮中、高剂量组能极显著提高衰老模型组小鼠脑指数(P0.01),山刺玫叶总黄酮低、中、高剂量组均能显著提高衰老模型组小鼠脾脏和胸腺指数(P0.05);山刺玫叶总黄酮中、高剂量组小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-4显著或极显著高于衰老模型组小鼠(P0.05,P0.01),而山刺玫叶总黄酮低、中、高剂量组小鼠血清中细胞因子IL-6、TNF-α显著或极显著低于衰老模型组小鼠(P0.05,P0.01);维生素E组小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α均有极显著差异(P0.01)。与衰老模型组比较,山刺玫叶总黄酮低、中、高剂量组小鼠脑组织的神经元细胞数量和细胞的坏死及变性情况均有明显减轻。山刺玫叶总黄酮对小鼠脾细胞有增殖作用,对ConA诱导的小鼠脾细胞中T-淋巴细胞增殖有抑制作用。由上述结果可知,山刺玫叶总黄酮具有良好的抗衰老作用,其作用机制主要是能够从抗氧化和免疫增强方面对机体各组织器官均起到延缓衰老的功效。此研究为合理开发利用山刺玫叶及其生理活性物质提供理论基础和科学依据,对山刺玫叶资源在食品领域和临床应用方面的开展运用具有积极意义。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ464
【图文】：

衰老模型,总黄酮,小鼠血清,差异显著

图 3.17 山刺玫叶总黄酮对衰老模型小鼠血清 IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α 水平的影响ig. 3.17 Effects of total flavonoids in leaves of Rosa davurica Pall. on serum IL-2、IL-4TNF-α concentration of aging model mice相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；与衰老模型组相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)h the control group, while with * means significant difference (*P<0.05), and with** means great significant difference (**P<0.01); Comparehile with#means significant difference (#P<0.05), and with##means great significant difference (##P<0.01).鼠脑组织病理切片观察

小鼠大脑,病理切片,皮层,衰老模型

图 3.17 山刺玫叶总黄酮对衰老模型小鼠血清 IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α 水平的影响Fig. 3.17 Effects of total flavonoids in leaves of Rosa davurica Pall. on serum IL-2、IL-4、ILTNF-α concentration of aging model mice空白组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；与衰老模型组相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)。ed with the control group, while with * means significant difference (*P<0.05), and with** means great significant difference (**P<0.01); Compared with roup, while with#means significant difference (#P<0.05), and with##means great significant difference (##P<0.01).3 小鼠脑组织病理切片观察

影响图,总黄酮,作用浓度,影响图

且随着山刺玫叶总黄酮剂量的增加，恢复程度也逐渐叶总黄酮对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响图 3.19 山刺玫叶总黄酮提取物对小鼠脾细胞增值的影响ffect of total flavonoids in leaves of Rosa davurica Pall. on spleen cell prolifEffects of total flavonoids in leaves of Rosa davurica Pall.9 所示，与模型组相比，随着总黄酮作用浓度的增加，刺激小鼠关系。当质量浓度为 200 μg/mL 时，山刺玫叶总黄酮 SI 值为

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