酶法拆分（R,S）-四氢呋喃-2-甲酸的研究

发布时间：2020-08-01 11:32

【摘要】：四氢呋喃-2-甲酸又称2-四氢糠酸,光学纯的四氢呋喃-2-甲酸是制备多种药物及化工原料的重要中间体。目前工业上拆分四氢呋喃-2-甲酸的方法以化学法为主,如使用麻黄碱多次进行拆分,该方法存在毒性大、步骤繁复、环境污染大等缺点。目前较少有使用生物法拆分的报道,且四氢呋喃-2-甲酸以及四氢呋喃-2-甲酸甲酯作为酸和酯类的物质,可使用脂肪酶作为其酯化或水解的反应催化剂,因此进行了酶法拆分四氢呋喃-2-甲酸以及四氢呋喃-2-甲酸甲酯的研究。以外消旋的四氢呋喃-2-甲酸为底物,使用了不同脂肪酶催化其与正丁醇的酯化反应,筛选出立体选择性较好的脂肪酶:Novozym 435。该脂肪酶以吡啶为溶剂,酸醇比为1:2,在30℃条件下反应为最佳条件。在此条件下,当底物浓度为0.1 mol/L,加酶量20 g/L,反应时间12 h,转化率为60%,产物(R)-四氢呋喃-2-甲酸丁酯对映体过量值ee_p可达70%。以外消旋的四氢呋喃-2-甲酸甲酯为底物,筛选能立体选择性水解该底物的脂肪酶,最终筛选出来源于米曲霉的脂肪酶具有高选择性,该酶优先水解(S)-四氢呋喃-2-甲酸甲酯,留下光学纯的(R)-四氢呋喃-2-甲酸甲酯。该酶催化水解四氢呋喃-2-甲酸甲酯的最佳条件为:磷酸盐缓冲液(pH7.0,0.2 M),温度30℃,当底物浓度为0.1 mol/L,加酶量为20 g/L时,反应52 h,转化率为74%,底物(R)-四氢呋喃-2-甲酸甲酯的ee_s为100%。对酶进行固定化可提高酶的催化活力,且使酶可重复使用。酶的固定化的方法很多,论文使用吸附法对米曲霉脂肪酶进行固定化实验。对大孔吸附树脂和离子交换树脂对米曲霉脂肪酶进行固定化研究,其中阴离子交换树脂Q为理想的固定化载体。在磷酸盐缓冲液中(pH7.0,0.02 M),加酶量为30 g/L,Q加量为200 g/L,30℃条件下,吸附5 h左右可将酶蛋白全部固定在树脂上。固定化酶的催化效率较游离酶有了大幅度提升,且保留了游离酶的立体选择性。底物浓度为0.1 mol/L,固定化酶的加酶量为100 g/L,在磷酸盐缓冲液(pH7.0,0.1 M)中,30℃进行水解反应的催化5 h,底物对映体过量ee_s可达99.1%,转化率76.3%。在对固定化酶进行回收后再进行催化反应,回收10次左右该固定化酶依然能保持较高的活性和选择性。
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ251.1
【图文】：

示意图,脂肪酶催化,布洛芬,乙酰吡啶

图 1-4 脂肪酶催化水解布洛芬酯示意图[41]Fig.1-4 Schematic diagram of the lipase-catalyzed membrane reactor for DKR ofibuprofen ester(2S,3R)-2-甲基-1-乙酰吡啶-2,3-二羧酸酯，是合成莫西沙星的中间体。Perla等[42]使用游离南极假丝酵母（C. antarctica）脂肪酶 B（CAL-B）对其进行水解，反应 16 h，转化率为 53%，对映体过量值 ees> 99%，对映体选择率 E 可达 80。NOCOOMeCOOMeCAL BBuffer , pH 7.5NOCOOMeCOOH NOCOOMeCOOMecis-(±)图 1-5 CAL-B 拆分(2S,3R)-2-甲基-1-乙酰吡啶-2,3-二羧酸酯[42]Fig.1-5 CAL-B resolution (2S, 3R)-2-methyl-1-acetylpyridine-2,3-dicarboxylate

四氢呋喃,甲酸,气相色谱图,底物

映体过量（公式（1）），C 表示底物的转化率（公式（2）），E 表示酶的光学选择性（公式（3））。eep= ([S] - [R]) / ([S] + [R])×100% (1)C = (C0- Ct) / C0×100% (2)E = ln[(1 - C)(1 - eep)]/ln[(1 - C)(1 + eep)] (3)公式中[S]和[R]表示(S)-构型酯以及(R)-构型酯的峰面积，C0表示底物的初始浓度（M），Ct表示反应后底物的浓度（M）。2.4 实验结果与讨论2.4.1 四氢呋喃-2-甲酸浓度标准曲线因酯化反应是在非水相环境中进行，为方便检测，亦使用 GC 法对底物四氢呋喃-2-甲酸的浓度进行检测，根据 2.3.4②的方法分析四氢呋喃-2-甲酸的色谱图如图 2-1 所示。

四氢呋喃,气相色谱图,脂肪酶

图 2-3 四氢呋喃-2-甲酸正丁酯气相色谱图Fig.2-3 Gas chromatogram of N-butyl tetrahydrofuran-2-carboxylate通过对实验室已购买的各类商品酶以及从浙江、安徽、河南等地采集的 500多份土壤中分离的菌种发酵冻干粉进行了初筛，即使用商品酶或冻干菌粉催化酯化四氢呋喃-2-甲酸。计算反应结束后产物四氢呋喃-2-甲酸酯的对映体过量 eep、转化率及 E 值。通过实验筛选出四种对四氢呋喃-2-甲酸的酯化具有较高活性和选择性的酶。结果如表 2-3。其中，Novozym 435 脂肪酶的光学选择性最好，E值为 5.62。因此选择使用 Novozyme 435 脂肪酶做进一步试验。表 2-3 四氢呋喃-2-甲酸酯化脂肪酶筛选结果Table 2-3 The screening of lipase for enantioselective esterification of 2-tetrahydrofuroic acid脂肪酶反应时间eep（%）转化率（%） E

【参考文献】