产木糖苷酶菌株的诱变育种、发酵优化、酶学特性及应用研究

发布时间：2020-08-01 16:41

【摘要】：可再生半纤维素的主要成分木聚糖降解为单体木糖的过程需要一系列酶的共同参与。该多糖的基本骨架为β-1,4糖苷键相连的D-吡喃木糖,并且含有以下侧链取代基,如乙酰基、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸。木聚糖的完全降解需要完整的木聚糖水解酶系,主要包括β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。本实验中所使用的黑曲霉(Aspergillus niger)可以产β-木糖苷酶和木聚糖酶,其中β-木糖苷酶水解可溶性低聚木糖和木二糖的非还原末端释放木糖。本研究首先对实验室保藏的一株黑曲霉产木糖苷酶的发酵条件和发酵培养基进行了优化。通过单因素优化实验确定了该菌产木糖苷酶的最优发酵条件。通过Plackett-Burman设计试验、Central Composite Design中心复合试验等方法确定了该菌株产木糖苷酶的最适发酵培养基组分。然后对该菌株进行紫外诱变筛选出一株高产木糖苷酶的菌株,并对其进行二次优化。最后对分离纯化后的木糖苷酶进行了表征,同时研究了该酶与木聚糖酶协同作用,主要研究结果如下。(1)确定实验室保藏菌株黑曲霉(Aspergillus niger)为出发菌株。通过测定细胞干重的方法测得该菌株的生长曲线,选取36h为种子培养时间。采用单因素实验、Plackett-Burman设计实验、Central Composite Design设计实验等方法确定了该菌株产木糖苷酶的最优发酵条件为发酵时间144h,发酵温度34℃,接种量7%,摇瓶转速为180 r/min,装液量110 m L/300m L,初始发酵p H为3.5。最佳发酵培养基组成为玉米芯粉31.55 g/L,酵母粉8.00 g/L,蛋白胨5.48 g/L,硫酸镁0.70 g/L,氯化钠1.00 g/L,氯化钙1.50 g/L。预测酶活为15.04 U/m L实测酶活为14.87 U/m L,结果相近,说明上述优化方法得到的实验结果是合理可信的。优化发酵条件和培养基组成后,木糖苷酶酶活是优化前的8.89倍。(2)对原始菌株CAN进行紫外诱变,紫外照射最佳时间为1.5 min,获得紫外诱变突变株CANT,经摇瓶发酵测定酶活为25.12 U/m L,比CAN提高了69%左右,并且具有良好的遗传稳定性。测定其生长曲线,选取40 h为种子培养时间。(3)采用单因素实验、Plackett-Burman设计实验、Central Composite Design设计实验等方法方法得到该菌株产木糖苷酶的最优发酵条件为发酵时间156 h,发酵温度34℃,接种量5%,摇床转速为160 r/min,装液量110 m L/300m L,初始发酵p H为4.0。最佳发酵培养基组成为玉米芯粉40.00 g/L,酵母粉5.00 g/L,蛋白胨22.41 g/L,磷酸二氢钾0.50 g/L,磷酸氢二钾0.50 g/L,硫酸镁0.50 g/L,氯化钠1.00 g/L,氯化钙1.50 g/L。预测酶活为47.02 U/m L实测酶活为46.77 U/m L,结果相差不大,说明采用上述一系列优化方法得到的实验结果是合理可靠的。优化发酵条件和培养基组成后,木糖苷酶酶活是优化前的1.86倍,是出发菌株CAN的27.97倍。(4)通过一步盐析和三步层析等分离纯化步骤,,最终得到纯化倍数33.68,比酶活1954.23 U/mg的高纯度酶蛋白,SDS-PAGE测得分子量约为121.0 KDa。对电泳纯的木糖苷酶进行表征,该木糖苷酶最适反应温度为70℃,在30℃~60℃范围下4 h后相对残留酶活仍有75%;最适反应p H为4.0,在p H 4~p H 10范围下4 h后相对残留酶活仍有70%。研究了木糖苷酶和木聚糖酶一起降解玉米芯粉的协同作用,两种酶一起降解玉米芯粉得到还原糖的量是单木聚糖酶降解产生还原糖量的347.1%。对两种酶降解玉米芯粉的产物进行了分析,发现单一木聚糖降解玉米芯粉的主要产物为木糖、木二糖、木三糖、木四糖等低聚木糖,两种酶一起降解玉米芯粉的主要产物对比单一木聚糖酶的降解产物中木糖含量明显增加,木二糖、木三糖、木四糖等低聚木糖的含量减少。
【学位授予单位】：湖北工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ925
【图文】：

作用位点,木聚糖,β-木糖苷酶

吡喃木糖基骨架组成，并且可以被不同的侧基取代，木聚糖来源的不同将导致聚糖侧链的数量和组成有些许差异。在纤维素后，半纤维素（主要组成成分为木聚糖）被认为是植物中第二丰的多糖。它是复杂的支链杂聚物，它们可以由戊糖（木糖和阿拉伯糖），己糖（露糖，葡萄糖和半乳糖）和糖醛酸（β-D-葡萄糖醛酸，α-D-α-甲基葡萄糖醛酸和 α半乳糖醛酸）组成[2-3]。木糖苷酶通过与不同酶的协同作用将它们水解成各自的糖组分。这种酶系统被称为木聚糖水解复合物，主要包括作用于多糖主链β-1,4-D-木聚糖酶和 β-木糖苷酶[4]。木聚糖酶和 β-木糖苷酶一起水解木聚糖寡糖从而释放木糖分子。复合物中的其它降解酶负责消除其特定的取代基，包括 α-L-阿拉伯呋喃糖酶（EC 3.2.1.55），乙酰木聚糖酯酶（EC 3.1.1.72），α-D-半乳糖苷酶（EC 3.2.1α-D-葡萄糖醛酸酶（EC 3.2.1.139），阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）和（反式对羟丙烯酸酯酶）对香豆酸酯酶（EC 3.1.1）[5-6]。这些酶被称为辅助酶或解聚酶，并木聚糖水解过程中与木聚糖酶和 β-木糖苷酶组合起作用。这些辅助酶能够作用骨架残基和取代基之间的键或取代基与取代基之间的键[7]，如图 1.1。

标准曲线,对硝基苯酚,标准曲线,设计试验

ett-Burman 设计试验筛选出的显著性因素为基础，为了进一，通过最陡爬坡试验然确定这些显著因素的最佳区域。依，设计合理的步长，增加实验的密集度，来逼近效果最好.2.3 优化后的实验条件。tral Composite Design 设计试验（CCD 试验）化设计试验通过合理地选取试验点和迭代策略, 克服了传物培养条件和培养基成分选择的优化中均取得了显著的成果，运用 Design-Expert 软件，对实验结果进行方差分析，析图，并预测最佳发酵培养基组成。发酵条件为 2.2.3 优化与分析基苯酚标准曲线的绘制

生长曲线,木糖苷酶,发酵周期,发酵培养基

0.000.010.020.030 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64体菌重（干时间（h）图 2.2 CAN 的生长曲线Figure2.2 The growth curve of Streptomyces althioticus CANN 的生长曲线如图 2.2 所示，20~48 h 此为菌株对数生长期，h 作为种子转接于发酵培养基。 CAN 产木糖苷酶发酵条件的优化周期对 CAN 产木糖苷酶的影响可知，发酵前期菌株利用营养物质进行生长繁殖。，酶活随升高，当发酵进行到 144 h 时酶活达到最高，为 1.672 U/mL，随着发酵培养基中营养物质的消耗和有毒物质的积累导降，故选择发酵周期为 144 h。

【参考文献】