发光杆菌SN35菌株次生代谢产物的分离鉴定及其抑菌活性研究

发布时间：2020-08-02 19:13

【摘要】：发光杆菌(Photohabdus temperate)是寄生于异小杆线虫(Heterorhabditis)肠道内的共生菌,被线虫携带进入昆虫体内后大量繁殖并产生大量的次生代谢产物,协同线虫一起杀死寄主昆虫。目前,从发光杆菌属的次生代谢产物中分离得到的二苯乙烯类化合物具有多种生物活性。为促进其在农业抗生素领域应用价值的开发,本试验通过对发光杆菌SN35进行大量发酵,采用固相萃取、柱层析和高效液相色谱等化学分离技术从发光杆菌SN35的发酵液粗提物中分离纯化得到9个活性化合物。通过NMR和MS波谱技术和相关文献调研确定了这9个活性化合物的结构,并初步探究了它们的生物活性。通过Plackett-Burman试验和响应面法对发光杆菌SN35摇瓶发酵培养条件进行了优化。主要结果如下:1.发光杆菌SN35菌株次生代谢产物的分离纯化及鉴定:对发光杆菌SN35进行大量发酵,获得48 L发酵液,利用大孔树脂固相吸附、二氯甲烷萃取共得到12.90 g粗提物。利用硅胶柱层析、凝胶柱层析和高效液相色谱等化学分离技术对粗提物进行分离纯化,共得到9个活性化合物。通过NMR和MS波谱技术和相关文献调研确定了9个活性化合物的结构,分别为temperatacinol A(1),temperatacinol B(2),temperatacinol C(3),temperatacinol D(4),3-羟基-2-异丙基-5-苯乙基苯基氨基甲酸酯(5),2-(1-羟基丙烷-2-基)-5-[2-苯乙基]苯-1,3-二醇(6),2-(1-羟基丙烷-2-基)-5-[(E)-2-苯乙烯基]苯-1,3-二醇(7),2-乙基-5[(E)-2-苯乙烯基]苯-1,3-二醇(8),2-异丙基-5-[(E)-2-苯乙烯基]苯-1,3-二醇(9),命名为化合物1-9。其中化合物1为新化合物,化合物2和3为第一次被分离纯化得到,之前已从发光杆菌的代谢产物中用HPLC/MS分析说明过,化合物4-9为已知化合物。2.化合物1-9抗真菌活性测定:采用菌丝生长速率法和微量肉汤稀释法对化合物1-9的生物活性做了测定。结果表明,化合物9(isopropylstilbene)对玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌和玉米纹枯病菌的菌丝生长具有良好的抑制作用,其EC_(50)值分别为10.5μg/mL,9.2μg/mL和9.8μg/mL,对水稻稻瘟病菌的抑制作用稍微差一点,EC_(50)值为29.4μg/mL。化合物5、6和7对玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌和玉米纹枯病菌的抑制作用一般,对水稻稻瘟病菌的抑制作用较差。化合物1、2、3和4对4种病原真菌的抑制作用都较弱,其EC_(50)值均大于50μg/mL。比较9个化合物的化学结构和其对应的生物活性,可推测出C-5上连接苯乙烯基(苯乙基)比连接烷基链有助于提高化合物的抑菌活性。3.isopropylstilbene(化合物9)对番茄灰霉病菌的离体抑菌活性及对灰霉病的防治效果:依据化合物的离体生物活性筛选结果,对生物活性较好的isopropylstilbene做了进一步的研究。采用凹玻片法测定了isopropylstilbene对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用,结果显示在10μg/mL,isopropylstilbene对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用为63.01%(百菌清为100%)。通过番茄盆栽试验,测定了isopropylstilbene对灰霉病的防治效果,当有效成分质量浓度为200μg/mL时,5%isopropylstilbene乳油对番茄灰霉病的防治效果为72.12%,其防效略低于阳性对照百菌清(81.61%)。对isopropylstilbene进行了简单的室内药害试验,当有效成分质量浓度为500μg/mL时,5%isopropylstilbene乳油对黄瓜苗和番茄苗均未产生药害。4.isopropylstilbene定量方法的建立:建立了高效液相色谱法快速测定发光杆菌发酵液中isopropylstilbene含量的方法。色谱条件:色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB,(4.60×250mm,5μm);流动相:68%甲醇水+0.1%甲酸溶液;进样体积:10μL;流速:1.0 mL/min,柱温:30-39℃;检测波长:247 nm。该方法的精密度RSD为0.56-2.62%,回收率为93.71-109.62%,线性方程为Y=10069X+3.7629(R~2=0.9974),线性范围是:0.002-5 g/L,以3倍信噪比计算最小检出限为2 mg/L,以10倍信噪比计算定量限为10mg/L。5.优势菌株筛选和发酵条件优化:通过薄层色谱法和高效液相色谱法对本实验室库存的18种发光杆菌进行了优势菌株筛选,结果均显示发光杆菌SN35的发酵液中isopropylstilbene的含量最多。通过单因素试验、Plackett-Burman试验和响应面法对发光杆菌SN35的摇瓶发酵培养条件进行了优化。单因素试验结果显示,在M培养基中添加亮氨酸,大大提高了isopropylstilbene的产量,在M培养基中添加氯化钠的量为3.01 g/L时有助于isopropylstilbene产量的提高。优化后的M培养基组成为:葡萄糖6.13 g/L,蛋白胨33.23 g/L,硫酸镁1.50 g/L,硫酸铵2.46 g/L,磷酸二氢钾0.86 g/L,磷酸氢二钾1.11 g/L,硫酸钠1.72 g/L,亮氨酸3.00 g/L,氯化钠3.01 g/L,蒸馏水1 L,pH值7.2-7.6。isopropylstilbene产量比优化前提高了2.22倍。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ455.4
【图文】：

示意图,中心组合设计,因素,中心组合

看出每个因素对响应值的影响及因素之间条件组合。用 Box-Behnken designs（BBD）或中）。这两种方法均可以对试验结果进行二它们的试验次数都大于试验因素数量的目前中心组合试验应用的较为广泛，因点可以用来检查弯曲，用于计算试验误差（刘乐乐，2010）。然而 Box-Behnken 设同时都处在高水平。Central Composite designs, CCD）是国际计法（Maneeboon et al, 2010）。该法一它们按照中心组合的方式组合起来，试验

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5 菌株发酵液粗提物 TLrude extract from Photoh析结果硅胶柱（350 mm ×300:5、 100:10、100:的 23 个馏分进行 TL将含有相同极性的化 g，其中 a 为 0.131 g，回收率为 87.70%

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图 2-1 SN35 菌株发酵液粗提物 TLC 检测结果Fig. 2-1 The TLC results of crude extract from Photohabdus temperata SN35 strain SN35 菌株粗提物的硅胶柱层析结果将收集到的 12.90 g 浸膏用正相硅胶柱（350 mm ×30 mm i.d.）分离纯化，依次选油醚）: V（乙酸乙酯）=（100:5、 100:10、100:20、100:30、100:40 和 0:100洗脱，每个梯度 3 L。将收集到的 23 个馏分进行 TLC 检测，以 V（石油醚）: V（酯）= 8:2，检测结果如图 2-2，将含有相同极性的化合物进行合并称重分为 a-f 6。分离后的样品总重量为 11.31 g，其中 a 为 0.131 g，b 为 2.388 g，c 为 5.606 g，.960 g，e 为 0.124 g，f 为 2.105 g，回收率为 87.70%。

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