多重响应性释药纳米粒子治疗细菌感染的研究

发布时间：2020-08-10 19:41

【摘要】：尽管抗生素在治疗传染病方面取得了巨大的成功,然而细菌感染仍然是全球最主要的健康问题之一。常规抗生素治疗细菌感染面临靶向分布差、生物利用率低、日益增长的耐药性、生物被膜内渗透性低、胞内细菌清除效果差、系统毒性等问题。近年来,纳米递送体系的迅速发展提供了细菌感染治疗的新策略。纳米递送体系可增强药物循环稳定性,靶向感染组织或细胞,并控制定点释放药物速率,从而增加感染部位生物活性药物的浓度,减少给药剂量和频率,改善治疗效果,减少药物副作用。本论文针对细菌靶向性、细菌被膜、胞内菌、耐药菌和非抗生素治疗等方面存在的关键问题,设计具有多重刺激响应性的载药纳米粒子,开展载体聚合物结构设计、刺激响应机制和治疗效果的研究。针对细菌治疗靶向性的要求,构建了以万古霉素为靶向基团的载药纳米胶束。通过开环聚合反应合成了能被脂肪酶降解的两亲性共聚物聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL,简称PECL_(2k)),并通过腙键接枝万古霉素(VAN)作为靶向细菌的基团,封装疏水性抗菌剂环丙沙星(CIP)形成载药纳米胶束Van-hyd-PECL_(2k)/Cip,其粒径约为76.9 nm,载药量约为4.5%。该纳米胶束能够靶向识别细菌,在酸和脂肪酶的作用下释放CIP,杀灭细菌。相对于自由药物,Van-hyd-PECL_(2k)/Cip纳米胶束通过增强渗透与滞留(EPR)效应和主动靶向在细菌感染部位富集,减少药物用量,利用感染部位的生化因子(H~+和脂肪酶)的刺激释放CIP,杀灭组织内的细菌,延长小鼠的寿命。基于生物被膜对抗生素渗透性和敏感性降低从而产生耐药性的现状,构建了酸和酶敏感的载药纳米胶束。通过N,N-二异丙基乙二胺(DIP)氨解聚乙二醇-聚天冬氨酸苄酯(PEG-PBLA)合成了具有酸敏感的两亲性聚合物PEG-PAsp(DIP)。将丁二酸酐羧基化的阿奇霉素(Az-sa)接枝到聚合物十八氨-聚天冬氨酸-二乙烯三胺(OA-PAsp(DET))的侧链得到具有脂肪酶响应的聚合物前药OA-PAsp(DET/DET-sa-Az)。聚合物与聚合物前药混合物自组装形成杂合纳米胶束DOEAz,之后通过静电吸附顺式乌头酸酐修饰的右旋酪氨酸(CA-Tyr),形成同时载有生物被膜分散剂右旋酪氨酸(D-Tyr)和抗菌剂阿奇霉素(Az)的杂合纳米胶束DOEAz@Tyr,其粒径为107 nm,Az的载药量约为19.1%,CA-Tyr的载药量约为1%。该纳米胶束能在生物被膜内酸性pH刺激下通过DIP质子化改变PEG-PAsp(DIP)亲疏水性,使纳米胶束粒径减小。与此同时断裂乌头酸酰胺键释放生物被膜分散因子D-Tyr引发纳米胶束电荷反装带正电,之后在脂肪酶的刺激下释放抗生素,使纳米胶束解体。相对于自由药物,DOEAz@Tyr杂合纳米胶束通过EPR效应在生物被膜感染部位聚集,并通过生物被膜表面孔道进入其内。在生物被膜内酸性刺激下纳米胶束粒径减小并且表面电荷发生变化,释放的D-Tyr破坏生物被膜的完整性,使小粒径带正电的纳米胶束扩散到生物被膜内层。在脂肪酶的作用下释放Az杀灭被膜内细菌,最终通过双重机制清除植入器械表面已形成的生物被膜,达到治疗体内生物被膜感染的目的。根据细菌分泌灭活酶从而产生耐药性的机理,构建了pH/活性氧(ROS)敏感的双药载体纳米胶束。将氨苄青霉素(Amp)通过ROS敏感基团(TK)与β-内酰胺酶(Bla)抑制剂苯硼酸(PBA)修饰的四苯乙烯(TPE)偶联,然后通过酸敏感的硼酸酯键偶联到β-环糊精(β-CD)上合成具有pH/ROS敏感的前药分子β-CD-PBA-TPE-TK-Amp(缩写为CPTTA)。通过金刚烷(Ad)修饰聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)的疏水端合成共聚物PEG-PCL-Ad(缩写为PECLA)。PECLA与CPTTA通过主客体反应络合后在水溶液中自组装形成pH/ROS双敏感的纳米胶束,其粒径约为113.6 nm,Amp的载药量约为8.3%。该纳米胶束具有多重敏感性,在生化因子(H~+和脂肪酶)的刺激下释放Bla抑制剂和抗生素的二聚体PBA-TK-Amp;在白炽灯光照下TPE能产生ROS使TK键断裂,释放抗生素Amp。与自由药物相比,PECLA@CPTTA纳米胶束能将Bla抑制剂和抗生素同时运输到感染部位,通过EPR效应在感染部位富集;在感染部位的酸和脂肪酶的刺激下释放二聚体PBA-TK-Amp,能抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分泌的Bla活性,避免β-内酰胺抗生素Amp水解,恢复MRSA对Amp的敏感性;之后在外界物理因子光的刺激下,TPE产生ROS使TK键断裂,释放抗菌素Amp杀灭游离或附着状态的MRSA,从而达到治疗耐药菌皮下感染的目的。针对抗生素在感染细胞内渗透性低、滞留效果差等问题,构建了主动靶向细胞的双酶敏感载药纳米颗粒。利用4-氨基丁酸作为引发剂,丙烯酸修饰的磷酸三乙酯(EPE-Ar)和丙烯酸修饰的四苯乙烯(TPE-Ar)作为单体,通过迈克加成反应合成了随机共聚物P(EPE-co-TPE),将甘露糖(Man)通过PEG接枝到共聚物侧链,获得能够靶向巨噬细胞的双酶敏感的共聚物Man-g-P(EPE-co-TPE)。通过迈克加成反应将去铁胺(DFO)接枝到丙烯酸修饰的环丙沙星(Cip-Ar)上合成嗜铁素环丙沙星(DFO-Cip,缩写为DC)。在水相中共聚物Man-g-P(EPE-co-TPE)能自主装形成发射蓝色荧光的纳米颗粒MPET,通过物理包裹DC与三价铁离子(Fe~(3+))的螯合物D_(Fe)C,形成荧光淬灭的载药纳米颗粒MPET@D_(Fe)C,其粒径约为135 nm,载药量约为11%。该纳米颗粒能够主动靶向巨噬细胞,促进抗生素在感染细胞内积累。在感染细胞内细菌大量分泌脂肪酶和磷脂酶的作用下,MPET@D_(Fe)C纳米颗粒会快速降解,释放嗜铁素抗菌剂D_(Fe)C杀灭胞内细菌,并通过降解产物TPE的聚集诱导发光效应监控这一过程。相对于自由药物,MPET@D_(Fe)C纳米颗粒能有效地清除胞内菌,有效地延长小鼠的寿命。基于常规抗生素的毒性和耐药限制,构建了不同于小分子抗生素杀菌方式的光热/一氧化氮(NO)联合治疗的纳米抗菌药物。通过异戊酸修饰聚乙二醇-聚赖氨酸(mPEG-b-PLL)的侧链合成了双亲阳离子聚合物mPEG-b-P(LL-co-LLIR)(缩写为PELI),并通过抑菌实验和溶血实验筛选出接枝率为50%的PELI作为抗菌聚合物。通过巯基乙胺与亚硝酸特丁酯反应合成具有热敏的亚硝基硫醇类NO供体(CysamNO)。利用黑磷量子点(BPQDs)静电吸附CysamNO形成BPQD-SNO,再与PELI静电相互作用制备载有NO供体和光热剂BPQDs的纳米颗粒PELI@BPQD-SNO,其粒径约为125.7 nm,BPQDs的携载量约为10%,NO供体的吸附量为0.034μmol/mg。该纳米颗粒提高BPQDs的稳定性,在近红外光(NIR)照射下10分钟会产生大量的热,同时温度的升高促进热敏感键S-NO断裂释放NO。PELI@BPQD-SNO具有广谱抗菌性,在热和NO协同作用下能破坏革兰氏阴性菌和阳性菌的细胞膜。相对于小粒径的BPQDs,PELI@BPQD-SNO纳米颗粒能通过EPR效应细菌感染部位富集,在NIR光照射下升高感染部位温度并释放NO,联合杀灭脓肿感染部位的细菌,促进伤口的愈合。
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R515;TB383.1;R943
【图文】：

根据抗菌机制（如图1-1 所示）可以将抗生素以分为以下几类：（1）干扰细胞壁合成的抗生素，如能抑制粘肽合成、造成细胞壁缺损的 β-内酰胺类、能抑制肽聚糖合成的糖肽类抗生素；（2）抑制蛋白质合成的抗生素，如大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类和恶唑烷酮类；（3）干扰核酸合成的抗生素，如氟喹诺酮类和利福霉素类；（4）破坏细菌膜结构的抗生素，如多粘菌素能与带负电的细胞膜发生静电相互作用，导致膜上的 Ca2+、 Mg2+失衡，破坏细胞膜结构，使细菌溶解死亡[6]；（5）抑制代谢途径的抗生素，如磺胺类和叶酸类似物等。图 1-1 抗生素作用的主要细菌靶点[7]：（A）抑制蛋白合成；（B）破坏细胞壁结构；（C）干扰叶酸代谢；（D）干扰 DNA 或 RNA 的复制。1.1.2 抗生素治疗存在的问题尽管抗生素的治疗功效已被充分认可，但目前的抗生素药物治疗存在许多局限性，如生物利用率低、对细菌感染部位渗透性差、不良副作用等。通过传统的口服或静脉注射给?

当作敌人赶出去，来减少细胞内的药物积；如革兰氏阳性菌和阴性菌产生了诺酮类抗生素的外排泵[17]。（2）产生灭活酶，即细菌会产生一种或多种水解酶来水解或修饰抗菌素药物，使其到达靶位前完全失活；如 Bla 会特异性的 β-内酰胺环发生水解，使其失去抗菌效果[18]；氨基糖苷类钝化酶会导致抗菌子结构发生改变（羟基磷酸化、氨基乙酰化或羟基核苷化），失去抗菌活性[19]。抗生素作用靶点，即细菌可以通过修饰或消除结合位点来改变抗生素的靶位霉素结合蛋白 2B 的改变，导致青霉素耐药[14]。（4）改变细胞壁通透性，即细调或改变抗生素进入细胞所需的外膜通道。随着耐药菌的出现，迫切需要开菌药物。然而，自 1980 年开始，每年新上市的抗生素种类正在逐年递减，原新的抗生素开发难度越来越大；另一方面，一般一种新的抗生素在上市后，两年时间就会出现新的耐药菌，且会刺激细菌变得更加顽强，使得治疗更加困，探索开发治疗细菌耐药感染的新策略，是目前亟需解决的重要问题。

图 1-3 （A）生物被膜的形成过程[30]；（B）生物被膜的耐药机制[14]。.1.5 胞内细菌感染先天免疫系统中的吞噬细胞（如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞）在预防细染和保护身体方面起着至关重要的作用[31]。当细菌入侵机体后，吞噬细胞会识别，吞噬后形成吞噬体，进一步与溶酶体融合形成吞噬溶酶体，然后通过多种机制灭细菌。其中包括刺激诱导吞噬细胞产生一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）、抗菌AMPs）等抗菌因子[32]；抑制细菌对铁离子、氨基酸、脂肪酸等重要营养物质的摄取发吞噬细胞自噬和胞葬来清除细菌[33]。然而，一些病原菌已经进化出了干扰巨噬

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本文编号：2788519