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家蚕几丁质脱乙酰基酶BmCDA7的生化性质表征及抑制剂筛选

发布时间:2020-08-10 19:34
【摘要】:几丁质脱乙酰基酶(EC 3.5.1.41,CDA)是参与几丁质修饰的关键酶,能将几丁质的基本结构单元N-乙酰-D-葡萄糖胺的乙酰基团脱去,形成壳聚糖并释放乙酸。CDA分布于昆虫的表皮、气管、中肠围食膜等多个富含几丁质的器官,干扰CDA的表达会造成昆虫发育异常以致死亡。因此CDA是潜在的害虫防治靶标,对CDA的抑制剂研究可应用于开发绿色生物农药。然而,目前仅有真菌和细菌CDA的抑制剂研究,尚无昆虫CDA抑制剂的报道。昆虫CDA蛋白结构与真菌和细菌CDA蛋白结构相似性较差,因此以往的研究对昆虫CDA抑制剂的开发借鉴意义有限。本论文以鳞翅目害虫靶标基因研究的模式昆虫家蚕的BmCDA7为研究对象,开展以抑制剂开发为目的的如下研究:(1)对重组BmCDA7进行毕赤酵母诱导表达,采用金属螯合层析法及离子交换层析法对其进行精细分离纯化,获得高纯度重组BmCDA7蛋白;(2)通过凝胶法结合荧光增白剂染色的方法,定性检测了重组BmCDA7的催化活性。活性染色结果显示,重组BmCDA7蛋白在紫外灯下呈现蓝白色荧光条带,表明重组BmCDA7能够催化乙二醇几丁质底物发生脱乙酰基反应;(3)基于检测催化反应释放乙酸量的活性测定方法,首先确定重组BmCDA7催化反应最适条件以及检测了其对不同几丁质底物的催化活性。结果表明,以乙二醇几丁质为底物时,重组BmCDA7的适宜反应温度是50°C 65°C,适宜反应pH为7.0 11.0。此外,该酶在低于60°C和碱性环境下具有较高的稳定性,对酸性环境较为敏感,在低pH条件下其酶活性较低且极易失活。在最适反应条件下,重组BmCDA7对乙二醇几丁质、胶体几丁质底物均具有催化活性,分别为2.9926和0.4270μmol/min/μmol;(4)测定了23种小分子化合物对重组BmCDA7酶活性的影响,筛选出ZINC33253064和ZINC33253026两种化合物对BmCDA7酶活性具有抑制作用,测得的抑制率分别达到(31.01±2.17)%和(25.53±1.62)%。综上,通过对重组BmCDA7蛋白的精细分离纯化和生化性质、抑制剂的研究,不仅加深了对家蚕几丁质脱乙酰基酶催化性质的认识,同时为开发特异性的生物农药用于害虫防治具有指导意义。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TQ450.1

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本文编号:2788512

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