布氏乳杆菌转化合成苯乳酸及其晶胶分离特性研究

发布时间：2020-08-12 02:03

【摘要】：苯乳酸是一种高附加值的酚醛酸,广泛存在于天然蜂蜜及中草药中。苯乳酸通过改变微生物生长情况和调控其群体感应对多种细菌和真菌具有抑制作用,是一种新型生物防腐剂;作为丹参素的类似物,与其药物机理相同,是合成抗血小板凝聚和心肌梗塞药物的关键前体;同时由于其优异的理化性质,可合成为高机械强度和高稳定性的新型聚苯乳酸材料。基于苯乳酸突出的性质,可广泛应用于化工、医药、食品工业和新材料等领域。生物合成法制备苯乳酸,其成本低、反应条件温和、可持续性强。并且针对苯乳酸高效分离的研究十分缺乏。本论文从具有高催化性能菌株筛选出发,探讨菌株和固定化细胞催化过程,提出应用天然优良菌株进行生物转化是苯乳酸工业化发展的方向,并利用双功能基团晶胶介质,实现一步法从转化液中分离苯乳酸。主要内容包括:(1)高催化活性苯乳酸菌株的筛选。本文从泡菜中分离、筛选得到一株具有较高催化活性的布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri GBS3)。探讨了菌株在不同底物作用下发酵和催化合成苯乳酸能力。结果表明,在发酵和催化过程中均可以分别利用苯丙氨酸和苯丙酮酸合成苯乳酸,且以苯丙酮酸为底物全细胞催化合成苯乳酸时产量最高,确定采用苯丙酮酸作为转化底物进行后续的实验研究。(2)苯乳酸转化过程的新型优化方法。进一步研究了 L.buchneri GBS3在不同发酵条件下的生长特性,得知溶氧量与菌体的催化能力正相关但不显著,确定了菌体的静置培养方式。建立新型优化方法——叠影取样均匀设计法,并确定了最佳转化条件:缓冲液pH值8.0,菌体浓度270mg/mL,苯丙酮酸浓度为13 mg/mL,葡萄糖浓度20mg/mL,转化时间15h;在优化条件下,苯乳酸浓度为10.93 mg/mL,摩尔转化率达83.07%。(3)L.buchneri GBS3的固定化研究。以甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)为基质制备pHEMA晶胶微球,用于固定化细胞研究,考察固定化细胞的批次转化和高密度培养情况。在一定范围内,颗粒粒径与微管内径正相关。pHEMA晶胶微球的孔隙结构十分发达,内部孔隙可达1～50μm,孔隙率达88.1%。将固定化细胞的载体微球置于含有底物的溶液中进行批次转化实验。结果表明,pHEMA载体微球中细胞经10次利用后仍具有生物活性,且转化能力明显优于游离细胞,细胞与载体之间的结合力较强,转化效率随着颗粒粒径的增加而增大。应用pHEMA载体微球进行固定化细胞的高密度培养。结果表明,随着颗粒粒径的增大,生物量也随之变大,细胞干重最高为15.6 mg/mL,为悬浮培养的6倍。同时使用海藻酸钠包埋细胞进行对比研究,结果表明海藻酸钠载体微球稳定性较差且固定化细胞效果低于pHEMA载体微球。(4)双功能基团晶胶介质对苯乳酸的吸附分离。依据苯乳酸的结构特点,在pHEMA晶胶基质接枝具有阴离子交换季胺基和疏水苄基的功能单体,获得双模式晶胶介质,用于分离苯乳酸。该晶胶介质的基础性能良好,以苯乳酸标准液为原料考察层析柱的静态吸附性能,在超纯水溶液中分离柱具有最大吸附容量为14.64 mg/mL。比较晶胶柱对无细胞转化液和细胞转化液中苯乳酸的分离效果。以0.3 M氯化钠溶液为洗脱剂,可一步法从细胞料液中收获高纯度苯乳酸,在流速为1～5 cm/min时,苯乳酸纯度和回收率分别在97.4%～97.8%和80.2%～90.8%范围内,与层析无细胞澄清料液结果相似。在流速为1cm/min时,无细胞转化液中苯乳酸纯度和回收率分别为98.4%和92.3%,且经20批次重复分离实验,苯乳酸的纯度和回收率分别保持在96.7～98.6%和91.4～93.4%之间,晶胶介质均表现出良好的分离和重复使用性能。结果表明,双功能基团晶胶介质从细胞转化液中直接分离苯乳酸效果良好,对苯乳酸具有高选择性,可实现一步分离过程。(5)苯乳酸的非吸附穿透行为模拟。采用课题组建立的数学模型,研究了晶胶床层结构,并探索苯乳酸在晶胶柱内的穿透行为。认为超大孔晶胶连续床是由不同尺寸的毛细管组成的毛细管群,每个毛细管具有各自的直径、长度、弯曲度及相同的管壁厚度。通过模型拟合得到晶胶柱内毛细管总数目、毛细管的平均孔径、骨架厚度及弯曲度等更多微观晶胶结构参数。在确定了上述参数后,通过模型拟合得到晶胶柱的渗透率、孔隙率、床层体积和非吸附条件下苯乳酸的穿透曲线。模型拟合值与实验测定值相近,拟合效果好,说明毛细管模型可以很好地描述晶胶柱的结构和小分子有机酸的非吸附穿透行为。本论文围绕苯乳酸合成,从菌株筛选、转化过程优化和细胞的固定化出发,重点研究乳酸菌的全细胞催化法和晶胶分离,通过双功能基团晶胶实现苯乳酸的高效分离,得到富集苯乳酸的转化液,并通过模型描述小分子有机酸的穿透行为,显示良好的应用前景。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ921.3
【图文】：

１．２．２苯乳酸的化学合成法逡逑苯乳酸的化学合成法大体可以分为以下几种：锌汞齐还原法、苯丙酮酸催化氢化法、逡逑不对称环氧化合成及ＳＮ２反应％其合成路线如图１．２所示。逡逑锌汞齐还原法合成是以苯甲醛为原料与乙酰甘氨酸先形成吖内酯，再经过酸裂解、逡逑苯丙酮酸生成以及Ｃｌｅｍｍｅｎｓｅｎ还原，共４个步骤面成。李光兴等［３６］以Ｒａｎｅｙ－Ｎｉ为催化逡逑剂将苯丙酮酸通过催化氢化反应，得到苯乳酸的白色结晶物，该合成方法得到的苯乳酸逡逑产率很高，收率和转化率均令人满意。Ｄｒａａｎｅｎ等［３７］在低温条件下，Ｌ－苯丙氨酸经过快速逡逑的分子内Ｓｎ２反应形成不稳定的脂族重氮盐，得到了邋ｏｔ－内酯，在室温下与溶剂水发生反逡逑应，再经过一个缓慢的分子内Ｓｎ２反应，水解内酯得到最终产物Ｌ－苯乳酸。由于苯乳酸逡逑是一类具有光学活性的手性物质，故其含有两种对映异构体。Ｈａｒａｄａｉ３ｘ］通过Ｄａｒｚｅｎ反应逡逑将获得的反式－Ｐ－苯基缩水甘油酸酯拆分

—ＣＯＯＨ逡逑（ｂ）逡逑图１．］苯乳酸抑制李斯特菌的抑菌机理：Ｕ）破坏细胞膜和细胞壁（ｂ）阻碍ＤＮＡ功能逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ｐｈｅｎｙｌｌａｃｔｉｃ邋ａｃｉｄ邋ａｉｍ邋ｆｏｒ邋Ｌｉｓｔｅｒｉａ邋ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ：邋（ａ）邋ｄａｍａｇｅ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ逡逑ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ａｎｄ邋ｃｅｌｌ邋ｗａｌｌ；邋（ｂ）邋ｉｍｐｅｄｅ邋ＤＮＡ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑１．２．２苯乳酸的化学合成法逡逑苯乳酸的化学合成法大体可以分为以下几种：锌汞齐还原法、苯丙酮酸催化氢化法、逡逑不对称环氧化合成及ＳＮ２反应％其合成路线如图１．２所示。逡逑锌汞齐还原法合成是以苯甲醛为原料与乙酰甘氨酸先形成吖内酯，再经过酸裂解、逡逑苯丙酮酸生成以及Ｃｌｅｍｍｅｎｓｅｎ还原，共４个步骤面成。李光兴等［３６］以Ｒａｎｅｙ－Ｎｉ为催化逡逑剂将苯丙酮酸通过催化氢化反应，得到苯乳酸的白色结晶物，该合成方法得到的苯乳酸逡逑产率很高，收率和转化率均令人满意。Ｄｒａａｎｅｎ等［３７］在低温条件下，Ｌ－苯丙氨酸经过快速逡逑的分子内Ｓｎ２反应形成不稳定的脂族重氮盐，得到了邋ｏｔ－内酯，在室温下与溶剂水发生反逡逑应，再经过一个缓慢的分子内Ｓｎ２反应，水解内酯得到最终产物Ｌ－苯乳酸。由于苯乳酸逡逑是一类具有光学活性的手性物质，故其含有两种对映异构体。Ｈａｒａｄａｉ３ｘ］通过Ｄａｒｚｅｎ反应逡逑将获得的反式－Ｐ－苯基缩水甘油酸酯拆分

基因工程和蛋白质工程的发展使得酶学在生物技术领域得到广泛的应用。与化学催逡逑化相比，生物酶催化具有催化效率高、专一性强及酶活性可调控等特点。苯乳酸的生物逡逑合成途径如图１．３所示，苯丙氨酸转氨为苯丙酮酸，苯丙酮酸进一步还原成苯乳酸。故应逡逑用关键酶过表达于工程菌株中或直接进行催化反应是一条可行的路线。逡逑（１）酶法转化苯丙氨酸合成苯乳酸逡逑苯乳酸合成开始于苯丙氨酸的分解代谢，苯丙氨酸首先在具有广谱催化活性的芳香逡逑氨基转移酶作用下将氨基基团转移至合适的ａ－酮酸受体。ａ－酮酸受体在谷氨酸脱氢酶作用逡逑下生成谷氨酸盐，并且谷氨酸脱氢酶的活性受到细胞氧化还原状态的影响，所以可以通逡逑过添加柠檬酸盐、果糖和葡萄糖等充当可供选择的电子受体，以此增加ＮＡＤ（Ｐ）＋促进苯逡逑乳酸的合成［５１］．ＤａｌＩａｇｎｏｌ等Ｗ通过在复合培养基中添加生物合成前体苯丙氨酸和酪氨酸、逡逑中间产物谷氨酸盐和（Ｘ－酮戊二酸以及电子受体柠檬酸盐来评价植物乳杆菌ＣＲＬ７７８产抑逡逑菌物质的能力，研究表明苯丙氨酸会促进苯乳酸的合成，由于氧化型ＮＡＤ＋含量的增加，逡逑７逡逑

【参考文献】

相关期刊论文 前9条

1 朱银龙;

本文编号：2789884