高效生物转化L-苯丙氨酸合成苯乳酸的过程优化

发布时间：2020-08-12 00:35

【摘要】：苯乳酸(Phenyllactic acid,PLA)是一种安全无毒且天然的新型广谱抗菌物质,可以被应用于医药、食品、化妆品和农作物等行业。本文以重组大肠杆菌BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh_(10)-fdh为研究对象,旨在降低发酵培养基的成本和提高3 L发酵罐水平上苯乳酸合成产量。在摇瓶水平上优化发酵培养基的碳源氮源浓度和种类,结合菌体密度和发酵成本选择最佳单因素;在3 L发酵罐水平优化菌体培养条件,考察搅拌转速和通气量对培养体系溶氧值(DO)及菌体密度的影响,为分批补料培养奠定基础;在3 L发酵罐水平优化菌体共表达酶的诱导条件,通过考察全细胞转化L-苯丙氨酸合成苯乳酸的能力,确定了诱导剂浓度、诱导时机和诱导温度。在全细胞转化过程中,添加适量葡萄糖能显著提高转化效率,本文还探讨了葡萄糖在提高苯乳酸转化效率的机理。具体研究结果如下:(1)摇瓶水平上最适发酵培养基组成及培养条件为:葡萄糖4 g/L、FM802安琪酵母浸粉24 g/L、KH_2PO_4 2.3 g/L、K_2HPO_4 12.5 g/L,初始pH 7.0,250 mL摇瓶装液量为25 mL,接种量4%,在37°C下,220 r/min培养14 h。(2)在3 L发酵罐上,采用上述培养基,优化了发酵条件(搅拌转速和通气量)和补料分批策略(恒速流加、pH-stat和DO-stat)。在搅拌转速为400 r/min,通空气量为1.5 vvm,采用恒速补料策略,发酵培养3 h开始将400 g/L葡萄糖以10 mL/h恒速补料10 h,在此条件下细胞干重达到13.71 g/L。(3)在3 L发酵罐上对诱导剂浓度、诱导时机和诱导温度进行优化,确定最佳诱导剂浓度为0.08 mmol/L,诱导时机为培养2 h之后,诱导温度为25℃。(4)在3 L发酵罐上优化全细胞转化条件:NADH再生、底物浓度、转化温度、pH、搅拌转速和通气量,结果表明,以葡萄糖作为辅酶NADH再生来源,当细胞干重为30 g/L、转化温度为37℃、pH 7.0、300 r/min和通空气量1.0 vvm时,在3 L发酵罐中生物转化30 g/L底物L-苯丙氨酸合成苯乳酸,产量为25.4 g/L,转化率达84.7%。(5)从胞内ATP水平的变化、细胞干重的变化、从葡萄糖合成苯乳酸的情况以及细胞膜完整性分析葡萄糖在提高苯乳酸转化效率的机理,研究结果表明,在全细胞转化过程中添加葡萄糖可有助于提高细胞中ATP的水平,缓解苯乳酸导致的细胞活力下降及ATP减少,维持细胞在转化过程中的活性;在全细胞转化过程前后,添加葡萄糖对细胞干重和细胞膜的影响不明显;重组大肠杆菌BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh_(10)-fdh可以利用葡萄糖直接合成苯乳酸,转化率最高为0.433%。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ921
【图文】：

生物合成途径,发酵罐

(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh为研究对象（图1-2），在摇瓶优化的基础上，研究了3 L发酵罐水平大肠杆菌BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh的培养条件，共表达酶的诱导条件、全细胞转化苯丙氨酸合成苯乳酸的条件以及探究了外源添加葡萄糖在全细胞催化过程中的作用。图 1-2 大肠杆菌 BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh 中苯乳酸生物合成途径Fig. 1-2 The phenyllactic acid biosynthetic pathway engineered into E.coli BL21(DE3) harboringpRSF-aad-ldh10-fdh本文主要从以下几个方面进行研究：（1）在摇瓶水平上，针对发酵培养基碳源氮源种类和浓度进行优化，在获得较多菌体前提下，与原始的 TB 培养基相比，需要减低发酵培养基的成本，为 3 L 发酵罐水平培养菌体奠定基础。（2）在 3 L 发酵罐水平上，研究了搅拌转速、通气量和分批补料策略对重组大肠杆菌生长的影响，按时间取样测定体系中残糖浓度和菌体密度并且通过在线软件监测pH 和溶氧的变化。（3）在 3 L 发酵罐水平上

葡萄糖,标准品,色谱质谱,葡萄糖溶液

图 3-16 苯乳酸从头（葡萄糖）合成途径Fig. 3-16 De novo synthesis pathway of PLA from glucose将细胞诱导培养后，离心收集，用不同浓度葡萄糖溶液（5 g/L、10 g/L、15 g/L0 g/L）重悬，37oC 培养 20 h。如图 3-17 所示，与标准品的色谱质谱图对比，发酵液与标准品具有相同的液相出峰时间和 m/z ，说明大肠杆 L21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh 可以将葡萄糖（不添加底物苯丙氨酸）转化为苯乳酸据标准品与样品的峰面积，计算出不同实验组别中苯乳酸的含量。STANDARD 0.05mg/mlTime2.00 4.00 6.00 8.00 10.00%020180626-7 1: TOF MSMS ES-TIC3.41e3AreaArea%100.00Area314.26Height3394Time4.294.29314STANDARD 0.05mg/mlm/z20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220%010020180626-7 582 (4.287) 1: TOF MSMS 165.00ES-165.1402147.173.0119.1103.1148.1166.1120180626-3 1: TOF MSMS ES-TIC1.90e3Area4.29168110020180626-3 586 (4.316) 1: TOF MSMS 165.00ES-165.1130

电镜图,电镜,葡萄糖

其中一组同时加入 1%葡萄糖（图3-19b），电镜结果显示，用 20 g/L 苯乳酸处理大肠杆菌 BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh，细胞结构变化不大，细胞膜损伤不明显；当同时用苯乳酸和 1％葡萄糖处理细胞时，细胞膜的表观形态与仅仅用苯乳酸处理的结果几乎一致，说明 20 g/L 苯乳酸对大肠杆菌BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh 细胞膜完整性影响可以忽略，葡萄糖的加入也未引起任何细胞形态变化。图 3-19 大肠杆菌 BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh 电镜图（a）仅采用 20 g/L 苯乳酸处理 8 h；（b）用 20 g/L 苯乳酸和 1%葡萄糖处理 8 hFig. 3-19 Cold FESEM images of E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-aad-ldh10-fdh.(a) Cells were treated with 20 g/L PLA for 8 h; (b) Cells were treated with 20 g/L PLA and 1% glucose for8 h江南大学硕士学位论文

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