整合型1,2,4-丁三醇合成菌株的构建及发酵条件优化

发布时间：2020-08-22 06:17

【摘要】：D-1,2,4-丁三醇(D-1,2,4-butanetriol,BT)是一种非天然生物合成化学品,应用于工业生产及生活中多个领域。目前为止,利用微生物代谢合成BT仍然依赖于外源基因的游离表达,其不稳定性对未来的工业应用存在潜在的不利影响,因此,本研究利用分子手段构建更稳定整合型BT合成菌株,敲除木糖分支代谢途径、弱化PTS系统、强化表达戊糖转运蛋白、阻断3,4-二羟基丁酸副产物途径,通过廉价乳糖诱导下共底物发酵合成BT,为后续放大研究提供借鉴。为构建整合型BT合成菌株并敲除木糖分支代谢途径,利用Red重组技术将外源基因kivD、xdh敲入到大肠杆菌木糖分支代谢途径关键基因xylAB位点,kivD、xdh酶活测定及PCR验证表明同时完成了整合与敲除,木糖转化为BT产量达到0.7 g·L~(-1),木糖转化率为0.12 mol·mol~(-1);为缓解重组菌在单一碳源条件下生长受限,添加5 g·L~(-1)葡萄糖,菌体生物量提高了36%,但木糖代谢速率下降了33%,BT产量仅为0.59 g·L~(-1);为抑制上述CCR效应,实现木糖、葡萄糖共底物发酵,利用同样技术将kivD、xdh整合至ptsHI位点,对大肠杆菌进行增加拷贝数和PTS系统改造,产量最高可达2.8 g·L~(-1)。为提高工程菌BT产量,研究强化戊糖转运蛋白提高木糖转运效率并阻断3,4-二羟基丁酸副产物代谢途径,通过过表达不同的戊糖转运蛋白基因,发现其中质子协同转运蛋白(XylE)的高效表达更有利于BT的合成,产量提高至4.37 g·L~(-1);重组菌已敲除木糖分支代谢途径的木糖异构酶、木酮糖激酶基因(xylA、xylB)和中间代谢产物2-酮-3-脱氧木糖酸(KDX)旁路代谢途径中的醛缩酶基因(yagE、yjhH),为进一步提高主代谢途径碳通量,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除3,4-二羟基丁酸副产物途径,醛脱氢酶基因feaB缺失有效增强主代谢途径对碳流的竞争力及木糖的转化效率,使得BT产量提高了37%,进一步增加到6.0 g·L~(-1)。为进一步提高BT产量和降低成本,优化底物糖浓度,并利用乳糖替代IPTG诱导外源基因的表达,结果表明:增加底物木糖、葡萄糖浓度有利于提高重组菌生物量及BT产量,经优化后达到6.8 g·L~(-1);利用无毒且价格低廉的乳糖替代IPTG诱导重组菌合成BT,并对乳糖浓度、诱导时机、诱导温度进行条件优化,BT产量可达到4.5 g·L~(-1),转化率为0.31 mol·mol~(-1);在5 L发酵罐中分批发酵重组菌,恒定的通气量及高搅拌转速有利于菌体的生长,与摇瓶发酵相比,生物量提高了38%,BT产量达到5.9 g·L~(-1)。本论文产BT重组菌稳定性问题的解决及整合型工程菌共底物发酵等研究,为后续放大研究打下基础。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ923;Q78
【图文】：

化学结构式,硝化甘油

图 1-1 BT 化学结构式Fig. 1-1 Molecular Stucture of BT要的药物合成中间体，它可以用于合成；且可降低香烟中的有害物质的含量，物1,2,4-丁三醇三硝酸酯(1,2,4-butaneE)的重要增塑剂，可与硝化甘油混合，以设备的推进剂，如导弹、飞机等[5-7]，逐步替代硝化甘油成为更安全、有效合成靠化学合成法，作为重要的化工产品之ner 首次以 3-丁烯醇为原料通过水合法提取方面优化生产，并取得了显著的[8-10]。目前工业合成BT 的方法主要有被 H2O2氧化后经高压氢化[12]；丙烯

苯甲酰甲酸,分支代谢途径,丁三醇,脱氢酶

江南大学硕士学位论文2003 年，研究人员首次以霉实假单胞菌(Pseudomonas fragi)为宿主，利用菌体自身脱氢酶催化反应合成阿拉伯糖酸及木糖酸，最终反应得率为 70%，后期通过基因工程手段在大肠杆菌中异源表达苯甲酰甲酸脱羧酶得到木糖酸，其筛选自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，再经过脱水、脱羧、还原三步反应转化为 BT，转化率可达到17.5%[15]。后期研究主要集中在以价格低廉的底物代替木糖生产 BT，2009 年，Frost 在大肠杆菌中表达磷酸酶基因(yfbT)及木糖脱氢酶基因(xdh)，并敲除副产物途径，重组菌可以廉价的葡萄糖为底物合成木糖酸，再经三步反应转化为 BT，使得合成产品的成本降低[17]。同年，Li[18]等在 E. coli BL21(DE3)中以葡萄糖为唯一底物构建了 BT 合成的代谢路径，首先葡萄糖经糖酵解和 TCA 循环途径得到苹果酸，再经过六步酶促反应实现苹果酸到 BT 的转化，其中包括 4-羟基丁酸脱氢酶、苹果酸硫激酶、4-羟基丁酸 CoA-转移酶、琥珀酸-半醛脱氢酶及醛/醇脱氢酶，相关酶基因都融合到质粒中诱导表达，BT 最终产量达到 120 ng·L-1。

染色体整合,宿主细胞,靶基因,质粒

粒的菌株进入大自然中也会造成环境污染。木糖转运效率有限且菌体生还未解决。因整合表达及其应用着生命科学技术的发展，利用生物法替代化学合成的方法生产化工产品展的大趋势，目前研究，构建的化学品合成菌株多都含有载体和诱导味着发酵过程中要添加抗生素和诱导剂，并且质粒在发酵和传代过程中大量复制加重了菌体的生长负担，其不稳定性及对菌体的危害限制了其建基因整合菌是为了构建出无诱导物和无质粒的菌株，优势在于在发酵导、基因的连续表达以及降低生产成本等[26]。天然的组成型启动子已广酵母中的靶基因表达来生产生物基化学品[27,28]和天然产物[29]。而在大肠系列表达载体，其需要抗性标记筛选并且 IPTG 诱导目的基因的表达生长造成巨大负担，连续传代过程中容易丢失造成发酵后期产率下降得携带抗性的菌体流入大自然也不利于绿色环保，利用 Red 重组技术将基因组中更适宜宿主细胞生长且避免上述弊端，整合机制如图 1-3。

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