几丁二糖脱乙酰酶的克隆表达与生物转化合成氨基葡萄糖的研究

发布时间：2020-08-22 13:00

【摘要】：氨基葡萄糖(GlcN)是一种天然小分子单糖,是当今世界上认可度较高的一种有效治疗骨关节疾病的药品、当作为膳食营养补充剂时能有效的减缓骨关节炎症。可广泛应用于医药、保健、农业及化妆品等领域。GlcN主要由甲壳素水解法和微生物发酵法制得,据报道,甲壳素水解法存在原材料受限,环境污染严重等问题,微生物发酵法存在产量低,菌体对GlcN不耐受等缺点。本研究利用几丁二糖脱乙酰酶(Dac)通过环境友好的生物催化法将底物GlcNAc高效水解为GlcN。首先,将来源于极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)的几丁二糖脱乙酰酶基因(Dac)在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌成功实现胞内表达,利用催化活力更高的重组枯草芽孢杆菌B.subtili-Dac全细胞催化合成GlcN。同时,将Dac在枯草芽孢杆菌中进行高效分泌表达,经过信号肽筛选及启动子替换,获得最优信号肽YncM和启动子P43,胞外酶活力达到18.6 U?mL~(-1)。在其构建质粒过程中获得了5’非翻译区(5’UTR)突变的质粒,构建出重组菌株BS-NMKmut-yncM-Dac,胞外酶活提高至1548.7 U?mL~(-1)。在此基础上,将编号为C4的N端编码序列(NCS)融合在Dac基因的N端,构建出重组菌株BS-NMKmut-C4-yncM-Dac,胞外酶活提高至2015.3 U?mL~(-1)。其次,通过定点饱和突变及高通量筛选技术获得催化活力明显提高的Dac突变体R157T,K_m值从原来的6.75 mM降低为5.15 mM,V_(max)值从4.94μM?s~(-1)提高到7.56μM?s~(-1),比酶活从2047.3 U?mg~(-1)提高到3112.2 U?mg~(-1)。最后,对B.subtili-Dac/R157T进行全细胞催化条件优化,最优转化条件为:底物GlcNAc终浓度50 g?L~(-1),细胞添加量18.6 g?L~(-1),转化体系pH 7.5,温度40oC,催化时间3 h。在3-L发酵罐中GlcN产量最高达35.3 g?L~(-1),摩尔转化率为86.8%。利用BS-NMKmut-C4-yncM-Dac/R157T发酵上清液进行酶法脱乙酰合成GlcN的条件优化,最优转化条件:底物GlcNAc终浓度50 g?L~(-1),酶终浓度6000 U?mg~(-1),温度40oC,催化时间25 min。在1-L发酵罐中GlcN的产量达到35.4 g?L~(-1),转化率为87.4%。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ925;TQ281
【图文】：

结构式,胞壁酸

易溶于水，无特殊气衍生物或胞壁酸的形式存室温环境下，其可在 pH降[1]。目前市场上 GlcN式存在，在室温下可稳定用单糖，是在人体中含量最骨的重要组成成分[4]。大骨细胞的生长促进软骨的图 1-1 GlcN 的结构式Fig. 1-1 Structure of GlcN

流程图,流程图,热球,菌属

酶的来源与种类（Dac）属于糖类酯酶，来源于热球菌将其水解为 GlcN。ShouheiMine[40]等途径，推断在热球菌属中均存在相类在同源蛋白，研究发现，在热球菌属 Pyrococcusabyssi 等菌株中均存在 Da氨基酸序列进行相似性分析；根据 Py框序列（ORF），以在 NCBI 上预测的这些细菌中的 Dac 序列的相似度如下uschitonophagus 相似度为 80%；Pyroco Tanaka[37]等人通过对来源于 T. kodakar酶学性质分析，研究结果表明 Dac 的最波[39, 41]等人对来源于 P. horikoshii 的几图 1-2 Dac 催化 GlcNAc2流程图Fig. 1-2 The process of Dac catalyze GlcNAc2

脱乙酰反应,催化剂

需利用强碱浸泡，并且需要多种酶同时参与，步骤复杂在来源及应用受限、生产效率低等问题。而利用微生物发酵法生产大降低了强酸强碱的使用量，但发酵液中无法实现高浓度的积累，放在 GlcN 的前体物质 GlcNAc 上，可实现在发酵液中大量积累 G将 GlcNAc 水解为 GlcN，但该过程需利用盐酸进行加热反应，会有，依然会造成环境污染及设备腐蚀等问题。因此，为了解决酸法水找到一种安全的方法来代替酸法水解，利用生物转化生产 GlcN，即cNAc 经脱氨基作用转化为 GlcN，高效地且以环境友好型的方法生产化学水解法、微生物发酵法和多酶复合催化法存在的步骤复杂、反染严重、生产设备易腐蚀和制备周期长的问题。以 GlcNAc 为底物酶催化，实现一步生产 GlcN，底物来源充足，不受原材料限制，制染小，且反应专一性高，体系中杂质少易于下游分离纯化，生产成源的脱乙酰酶，来源于极端嗜热古菌（PyrococcushorikoshiiOT3）c 为底物进行高效的催化水解反应生成 GlcN，因此选择以 GlcNAc剂采用生物催化法生产 GlcN。本研究中的脱乙酰反应过程如图 1-

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