光滑球拟酵母转录因子CgRds2应答环境胁迫的生理机制

发布时间：2020-08-28 14:06

　　微生物在自然生长和发酵生产过程中经常会面临胁迫环境,抑制菌体生长并且降低发酵产物的产量。通过调节转录因子的表达来抵御环境胁迫已经成为一种有效的策略。本论文以一株光滑球拟酵母Candida glabrata ATCC 55为研究对象,以解析光滑球拟酵母抵御盐胁迫和酸胁迫的生理机制为研究目的,利用分子生物学和生物化学等分析方法,就转录因子CgRds2应答盐胁迫和酸胁迫的生理机制展开研究,主要结果如下:1.采用基因敲除和回补表达的方法构建了敲除菌株Cgrds2Δ和回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2,发现:在1.5 M NaCl条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ的细胞浓度和细胞存活率分别降低了23.4%和39.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的细胞浓度和细胞存活率分别提高了10.2%和6.3%;在pH 2.0条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ的细胞浓度和细胞存活率分别降低了32.6%和56.9%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的细胞浓度没有显著变化,但细胞存活率提高了17.6%。2.通过转录组数据分析发现,盐胁迫下敲除菌株Cgrds2Δ中糖酵解、核糖体生物合成和rRNA转录等路径中基因的转录水平显著上调;脂质代谢、MAPK信号传导和细胞周期等路径中基因的转录水平显著下调,其中脂质代谢路径中甘油磷脂代谢基因的表达量变化最为显著。进一步研究盐胁迫下CgRds2的调控机制发现,MAPK路径中的关键激酶CgHog1能够与转录因子CgRds2发生相互作用,并且CgHog1通过磷酸化CgRds2的Ser64和Thr97两个位点激活转录因子CgRds2。最后,CgHog1介导CgRds2调节甘油磷脂基因的表达、甘油磷脂组分和细胞膜完整性。在1.5 M NaCl条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ中甘油磷脂基因的转录水平显著降低,总磷脂含量和细胞膜完整性分别降低了30.3%和47.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2中总磷脂含量和细胞膜完整性分别提高了27.2%和12.1%;磷酸化位点突变菌株Cgrds2~(2A)中Cg Rds2与甘油磷脂基因的结合程度显著降低,总磷脂含量和细胞膜完整性分别降低了29.4%和21.8%。3.通过转录组数据分析发现,酸胁迫下敲除菌株Cgrds2Δ中减数分裂、蛋白质转运和转录过程等路径中基因的转录水平显著上调;翻译过程、细胞膜生物合成、氨基酸代谢和能量代谢等路径中基因的转录水平显著下调。进一步研究酸胁迫下CgRds2的调控机制发现,钙离子响应路径中的钙调磷酸激酶CgCmk1能够与转录因子CgRds2的PAS结构域发生相互作用,激活转录因子CgRds2的表达,使其从细胞质转移到细胞核中发挥作用。最后,CgCmk1介导CgRds2调节能量代谢基因的表达、胞内ATP含量和细胞膜通透性。在pH 2.0条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ中能量代谢基因的转录水平显著降低,胞内ATP含量和细胞膜通透性分别降低了33.5%和23.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2中胞内ATP含量和细胞膜通透性分别提高了41.5%和18.8%;PAS结构域缺失菌株Cgrds2-pas中CgRds2与能量代谢基因的结合程度显著降低,胞内ATP含量和细胞膜通透性分别降低了30.7%和19.1%。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ920.1
【部分图文】：

理化性质,细胞膜,渗透压,氧胁迫

图 1-1 膜组分对细胞膜理化性质的影响ig. 1-1 Physical membrane properties are influenced by lipid composit御环境胁迫的研究现状和工业发酵过程中，微生物常常面临高温、渗透压、活。细胞膜作为保护细胞内部环境的第一道屏障，对于细（1）高温会严重影响细胞内正常有序的生理机制。高温的信号感受器，通过一系列的信号传导路径降低 Δ9 去平，并且触发脂肪酸合成酶基因 FAS2 的表达，使得饱和而降低细胞膜的流动性，对热胁迫环境做出响应[15]。（2致渗透压胁迫，缓解渗透压胁迫并提高目标产物的产量研究表明，渗透压胁迫下，细胞内不饱和脂肪酸（UFA温度降低，从而使细胞膜流动性增加[16]。（3）氧胁迫是吸收活性氧之间不平衡而造成的一种胁迫环境。研究表解氧胁迫的有效策略。例如，过表达麦角甾醇合成路径麦角甾醇的合成，降低细胞膜对过氧化氢的通透性，从

转录因子,磷脂酶,胁迫环境,酿酒酵母

图 1-2 锌指转录因子 DNA 结合结构域Fig. 1-2 Structure of DNA-binding domains of zinc cluster transcription factor亮氨酸拉链转录因子包括 Sko1、Yap1 等。酿酒酵母中转录因子 Yap1 通过调节G15 的表达控制细胞内磷脂含量[41]。转录因子 Yap1 能够结合在基因 ATG15 的启域，敲除转录因子 Yap1 会降低基因 ATG15 的转录水平。利用免疫沉淀结合磷脂鉴定出基因ATG15的编码蛋白是一种磷脂酶，促进磷脂在sn-1的位置发生水解反同位素示踪法检测基因 ATG15 敲除菌株中磷脂含量发现，PC、PE、PI 和 PS 的著降低，而过表达基因 ATG15 后，PC、PE、PI 和 PS 的含量显著增加。磷脂酶 A功能部分依赖于转录因子 Yap1 的调节，因此转录因子 Yap1 能够参与细胞内磷脂调节。转录因子 Sko1 参与抵御膜脂合成受损引发的胁迫环境。在白色念珠菌Gpil4 是糖基磷脂酰肌醇（GPI）合成路径中甘露糖转移酶的催化亚基，缺失 CaG导致 GPI 合成受损，进而激活 HOG 胁迫响应路径以及其下游转录因子 CaSko1 42]，从而对胁迫环境做出响应，但具体的调节机制还不清楚。在酿酒酵母中，鞘合成受损同样会触发 HOG 路径，转录因子 Sko1 也参与响应鞘脂合成受损造成的境[43]。螺旋-突环-螺旋转录因子和螺旋-转角-螺旋转录因子的DNA结合域结构均由α

组氨酸,标记基因,片段,转化子

导入出发菌株CgHTUΔ 中，在缺乏组氨酸的 YNB 平板上筛选转化子并进行菌落 PCR 验证，结果如图3-1D 所示。提取阳性转化子的基因组，以此为模板扩增敲除框片段，测序正确的突变株则为基因 CgRDS2 敲除菌株，命名为 Cgrds2Δ。图 3-1 敲除菌株 Cgrds2Δ 的构建与验证Fig. 3-1 Construction and verification of the Cgrds2Δ strain注：（A）扩增 CgRds2 敲除框的三个片段：左臂 L、标记基因组氨酸 H 和右臂 R；（B）融合 PCR 构建敲除框 LHR；（C）pMD19-LHR 菌落 PCR：泳道 1 和 2 为阳性转化子，+为敲除框片段，-为阴性转化子；（D）酵母转化子菌落 PCR：泳道 1 和 2 为阳性转化子，-为阴性对照。以光滑球拟酵母 CgHTUΔ 的基因组为模板，扩增带有酶切位点的基因 CgRDS2，得到大小为 1395 bp 的片段

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