类球红细菌中葡萄糖跨膜转运与代谢的研究

发布时间：2020-09-02 13:58

　　 糖类物质作为一种碳水化合物,为生物体提供重要的营养和能量。葡萄糖作为一种单糖,在工业生产中应用最为广泛。细胞对葡萄糖的转运和代谢制约着菌体生长和目的产物得率,从而影响工业生产的成本和效率。类球红细菌富含多种营养药用成分,在食品、医药领域具有较高的应用潜力,但该菌在葡萄糖基质中生长缓慢。目前,对于类球红细菌的葡萄糖代谢已有相关研究,但其转运机制尚不清楚。本论文以类球红细菌2.4.1(Rhodobacter sphaeroies 2.4.1)为研究对象,旨在阐明葡萄糖跨膜转运机制,提高葡萄糖代谢速率。主要研究结果如下:(1)葡萄糖跨膜转运相关基因的检索及功能预测。通过检索NCBI中类球红细菌2.4.1全基因组序列,发现与葡萄糖跨膜转运相关的两个基因:glk和fruA,分别编码非磷酸转移系统(non-PTS)的葡萄糖激酶(Glk)和磷酸转移系统(PTS)的蛋白EIIBC。(2)glk和fruA基因功能的研究。通过对Δglk、ΔfruA、ΔglkΔfruA与野生型的表型及摇瓶发酵结果分析:在以葡萄糖为唯一碳源的SMM平板上,突变株ΔfruA长势和野生型没有明显差异,Δglk和ΔglkΔfruA长势较弱。摇瓶发酵结果表明,在对数生长期前期,野生型生长较快;在对数生长期中后期,ΔfruA生长最快,Δglk和ΔglkΔfruA生长明显受到抑制。现象表明,类球红细菌葡萄糖跨膜转运需要依赖PTS和non-PTS系统的共同作用,其中Glk对跨膜转运作用关键。(3)葡萄糖其它跨膜转运途径的探索。突变株ΔglkΔfruA仍能在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中缓慢生长,推测存在其它跨膜转运途径。经生物信息学分析,葡萄糖进入类球红细菌2.4.1周质空间后,可能经葡萄糖脱氢酶(Rsp-2673编码)作用生成葡萄糖酸进入细胞内。实验通过无痕敲除,获得突变株ΔRsp-2673,ΔfruAΔRsp-2673,ΔglkΔfruAΔRsp-2673和ΔglkΔRsp-2673,与野生型进行表型和摇瓶发酵分析发现,该途径对类球红细菌葡萄糖跨膜转运影响微弱,其中ΔfruAΔRsp-2673生物量最大。(4)葡萄糖跨膜转运与代谢的强化。实验以ΔfruAΔRsp-2673为出发菌株,分别构建了glk、edd、glkE.coli和galPE.coli基因的过表达菌株。结果表明:强化non-PTS系统,过表达glk的菌株生长明显受到抑制;强化ED途径,过表达edd的菌株葡萄糖代谢速率有所提高,但前期生长较慢;强化跨膜转运,过表达galPEcoli的菌株葡萄糖代谢速率极大提高,并且获得较大生物量。最终,本论文对ΔfruAΔRsp-2673-GalP/OP进行摇瓶发酵分析,其生物量较野生型提高70%,耗糖速率提高65%。
【学位单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ920.1
【部分图文】：

中［１（１１１１，属于转运蛋白家族，可转运２０多种碳水化合物［１２］。通常，该系统由两种耦逡逑合能量的非专一性蛋白，酶丨（Ｅｌ）逦和磷酸组氨酸搬运蛋白操纵子），逡逑以及底物特异性识别酶ＩＩ邋（ＥＩＩ）邋［１４］组成，典型ＰＴＳ蛋白通透酶组成成分如图１－２。逡逑？逦？邋■邋＇邋Ａ：：：邋＇邋—邋■．逡逑Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ逡逑媂．：：ｊ邋ｋＳａｉ逡逑＼逡逑１邋ＨＰｒ邋］逦ｓＳＴｅ＇邋－Ｐ逡逑ＰＦＰ邋＾逦＜逡逑Ｐｙｒｕｖａｔｅ逡逑图１－２典型ＰＴＳ磷酸基团转移原理图描述［２２］逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｅｐｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ邋ｔｒａｎｓｆｅｒ邋ｏｆ邋ａ邋ｔｙｐｉｃａｌ邋ＰＴＳ逡逑ｅｎｚｙｍｅ邋Ｉ，Ｍｇ２—逡逑Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ邋＋邋ＨＰｒ邋逦＞邋ＨＰｒ－Ｚ３邋＋邋Ｐｙｒｕｖａｔｅ逡逑ｅｎｚｙｍｅ邋ＩＩ，邋Ｍｇ２＋逡逑ＨＰｒ－／）邋＋邋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ逦＞邋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－尸邋＋邋ＨＰｒ逡逑图１－３磷酸化过程反应式逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑研究表明，ＰＴＳ蛋白具有的磷酸化状态和碳水化合物的可用性以及细菌自身的能逡逑量状态紧密关联。具体而言，ＰＴＳ系统给细菌提供了一个完整的代谢机制，这种代谢逡逑机制保证细菌在不同的环境下仍然能够最大化的利用碳水化合物。另外

红细菌中对两种酶ＢＬＡＳＴ发现，葡萄糖脱氢酶（Ｒｓｐ－２６７３编码）具有很高一致性，逡逑但未发现葡萄糖酸脱氢酶。根据类球红细菌２．４．１数据库，类球红细菌以葡萄糖为底逡逑物进行发酵时，其跨膜转运及代谢机制如图１－８，但其具体转运方式尚不明确。逡逑８逡逑

图２－１邋ｐＬＨ邋１４６图谱逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＬＨ邋１４６逡逑体邋ｐＬＨ３５９邋（ｐＬＨ１４６：：ｇ／々ＬＲ）的构建逡逑尺／ＡＲ白勺获得逡逑

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本文编号：2810689