贝伐单抗仿制药生物活性检测方法建立及对发酵工艺产品的检测

发布时间：2020-09-19 13:30

　　血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)是在细胞内调节血管生成的一种重要因子,其在肿瘤组织中高水平表达。肿瘤血管是肿瘤发生、发展和转移的关键性因素,如果切断肿瘤血管对肿瘤的营养供给,原发性肿瘤的生长不会超过2mm,肿瘤转移也将无法实现。因此,阻断VEGF的作用,已经成为肿瘤治疗中的一个研究热点。贝伐单抗(Bevacizumab)是针对VEGF靶点的人源化的一种单克隆抗体,它可以与VEGF发生特异性结合,而抑制下游信号通路,使VEGF失去生物活性,达到抑制肿瘤血管生长的作用。基于其良好的疗效和临床需求的不断提高,在全球范围内掀起了贝伐单抗生物仿制药研发的热潮。在单抗类生物仿制药的研发生产中,候选药与原研药的相似性评价要贯穿始终,其中生物学活性是生物仿制药的关键质量属性之一,在研发生产中,应建立一套稳定、可靠的生物学活性检测方法,对生物仿制药进行质量控制。本研究的目的是在贝伐单抗仿制药的研发生产中建立其生物活性的检测方法。此研究中,我们应用人脐静脉上皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)增殖抑制法和表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)法进行生物活性检测方法的开发,需要优化的实验条件包括:VEGF的最佳浓度、样品的最佳起始浓度、稀释倍数、稀释梯度以及配体和分析物的浓度。检测方法经过验证后符合方法学的验证标准,并应用该方法对候选药样品进行生物活性的检测。研究结果如下:1.在基于HUVEC增殖抑制法活性方法的开发实验中,确定VEGF的最适作用浓度为30 ng/m L,样品起始浓度是3μg/mL,稀释倍数为3倍,稀释梯度定为8个梯度;经过验证,该实验方法专属性较强,仅在贝伐单抗生物仿制药中呈现相应的剂量关系曲线,连续6次实验线性结果的R~2值均在97%以上;重复性6次实验结果样品的EC_(50)0 RSD%25%;准确性和中间精密度实验结果样品的Specific activity的值均在70%~130%之间。2.在基于表面等离子共振技术(SPR)活性方法的开发实验中,确定配体浓度0.5μg/mL,分析物浓度2.3μg/mL为最佳实验条件。3.在贝伐单抗生物仿制药样品制备工艺中,通过对培养温度、pH值、转速等试验条件进行优化,最终确定培养温度为37℃、pH值为7.1、初始转速200 rpm,第七天调到300 rpm为最佳细胞培养条件。4.应用HUVEC增殖抑制法对贝伐单抗仿制药的发酵工艺产品进行活性检测,其候选药的Specific activity的值为98.47%。同时按照以上基于SPR技术建立的活性检测方法对该候选药进行检测,得到其结合速率常数ka(1/Ms)值为8.46E+05,解离速率常数kd(1/s)值为1.61E-04,亲和力KD值为1.90E-10。结果表明,基于HUVEC增殖抑制法开发的活性检测方法专属性强,线性及重复性好,准确性及中间精密度高;在基于表面等离子共振技术活性方法开发实验中,标准品和候选药样品的亲和力值极为接近,动力学曲线几乎相同,两种方法都可用于贝伐单抗生物仿制药生物活性的检测,具有潜在的临床参考价值。
【学位单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ460.7;TQ920.6
【部分图文】：

细胞计数,细胞库,中国药典

图 3.1 HUVEC 细胞计数结果Fig. 3.1 The count of HUVEC cellsC 细胞库无菌检测按照中国药典（2015 版）要求，对 HUVEC 检测用细胞库进

细胞库,作用浓度

图 3.2 HUVEC 细胞库支原体检测Fig. 3.2 Detection of mycoplasma in HUVEC cell bankM：DNAmarker；1，2：阴性对照；3，4，8，12，16：阳性对5，6，7：细胞库-F1；9，10，11：细胞库-F2；13，14，15：细胞GF 最适作用浓度优化

最佳稀释倍数,梯度,稀释倍数,起始浓度

图 3.3 VEGF 刺激 HUVEC 细胞增殖曲ose-response curve of VEGF stimulate HUVEC p、稀释倍数、梯度的优化品最适起始浓度，最佳稀释倍数及稀释梯度等

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