接骨木叶中总黄酮的提取及抗骨质疏松作用研究

发布时间：2020-09-22 07:52

　　接骨木(Sambucus Williamsii Hance)为忍冬科接骨木属植物,别名舒筋树、马尿骚、接骨草等,分布于温带和亚热带地区,拥有20多个物种。接骨木适应性较强,对气候要求不严,生长在我国东北,西南和华北等地。接骨木资源在民间广泛应用于治疗活血化癖、舒筋活络、续筋接骨、消肿止痛等,近代药理学表明接骨木中含有丰富的化学活性成分,主要有酚酸类、黄酮类、三萜类、木质素类、甾醇类等,能够抗菌消炎、清热解毒、祛风除湿、消肿止痛。临床应用还将接骨木制成配剂、膏药、蜜丸、汤剂等广泛应用于治疗骨折、跌打损伤和骨质疏松。本研究旨在对接骨木叶中黄酮类成分进行提取工艺优化及对其纯化方法进行考察,并探究接骨木叶总黄酮的抗氧化作用及其抗骨质疏松作用机制。采用乙醇法对接骨木叶总黄酮进行提取,以提取时间、提取温度、液料比、乙醇体积分数等进行单因素水平分析,并通过Box-Behnken试验确定最佳提取条件;接骨木叶的粗黄酮纯化工艺是通过静态吸附实验对AB-8大孔吸附树脂、D4020大孔吸附树脂、D101大孔吸附树脂、NKA-9大孔吸附树脂、S8大孔吸附树脂五种树脂中进行筛选,动态吸附实验的样品液体积、上样速度、样品浓度、样品PH值、洗脱剂用量、洗脱剂体积分数等6个条件进行筛选确定纯化最优水平;体内抗氧化实验采用乙醇诱导小鼠建立氧化损伤模型,设计接骨木叶总黄酮低(80.5mg/kg)、中(161mg/kg)、高(322mg/kg)剂量组,并以VC作为阳性对照进行灌胃。给药后,对小鼠的血清和肝脏中的丙二醛(MDA)含量、还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)水平进行测定,并对肝脏组织进行病理学分析,以考察接骨木叶总黄酮对酒精造成肝细胞氧化损伤的保护作用;在抗骨质疏松研究中分别采用维甲酸和链脲佐菌素建立小鼠骨质疏松模型,设计接骨木叶总黄酮低(80.5mg/kg)、中(161mg/kg)、高(322mg/kg)剂量组,以维D钙片为阳性对照,进行灌胃,检测小鼠钙、磷、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、骨钙素(BGP)含量,并制作小鼠股骨病理学切片讨论接骨木叶黄酮的抗骨质疏松作用相关机制。试验结果如下:1.通过Design-Expert8.06软件中Box-Behnken分析可知,乙醇体积分数(A)、液料比(B)、温度(C)对接骨木叶总黄酮得率影响主次顺序为CAB,其中得到最佳提取工艺条件为提取温度70℃,提取时间60min,乙醇体积分数70%,液料比70:1(mL:g),三次平行试验验证其得率平均值为7.101%。2.通过对5种大孔吸附树脂的静态吸附和解吸试验结果可知,利用D101大孔吸附树脂对接骨木叶总黄酮的纯化效果最好。通过大孔树脂动态吸附的单因素筛选试验结果表明,接骨木叶总黄酮的动态解吸最佳条件为50%乙醇洗脱液体积为40mL,流速1.5mL/min,样品溶液浓度为1.2mg/mL。纯化接骨木叶中总黄酮得率为15.43mg/g,比纯化前总黄酮含量提高73%。3.抗氧化试验结果表明,接骨木叶总黄酮中、高剂量组可显著提高的血清和肝脏中SOD、GSH水平(P0.01),降低MDA含量(P0.01),消除自由基,达到良好的体内抗氧化效果。肝脏组织的病理学结果表明,接骨木叶总黄酮的低、中、高剂量组可有效降低小鼠肝脏细胞的脂肪含量,明显改善肝脏细胞的溶解现象,说明接骨木叶总黄酮可减少小鼠肝脏组织细胞脂肪的积聚效应,能够减轻酒精对肝细胞的氧化损伤。有资料显示,氧化应激是导致骨质疏松的重要原因之一,本研究表明,接骨木叶总黄酮具有良好的抗氧化作用,所以对骨质疏松的产生起到有效预防作用。4.抗骨质疏松试验结果表明,在维甲酸造成的小鼠骨质疏松模型中,接骨木叶总黄酮能够显著提高小鼠血清中钙和ALP水平,降低P、ACP、TRAP、BGP水平,可说明接骨木叶总黄酮能够对由维甲酸引起的骨质疏松具有良好的治疗作用。在链脲佐菌素造成糖尿病合并小鼠骨质疏松模型中,接骨木叶总黄酮能够显著升高血清中钙,ALP水平,降低P、ACP、TRAP、BGP水平,从而起到抗骨质疏松的作用。通过上述接骨木叶总黄酮治疗这两种不同骨质疏松模型的效果可以发现,接骨木叶中总黄酮均可对两种骨质疏松具有良好的治疗效果,尤其对维甲酸的治疗效果更好,所以推测其抗骨质疏松原理可能是代替雌激素,进而起到良好的抗骨质疏松作用,但其作用机制还有待进一步研究。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ464
【部分图文】：

黄酮,体积分数,乙醇,总黄酮

15Fig. 3-1 Effect of ethanol volume fraction on flavonoid，当乙醇体积分数在 30%-50%时，总黄酮得率基-70%时，总黄酮的得率不断提高，最高可达到 7酮得率反而下降，可能是由于有些黄酮类物质是溶出，另外当乙醇体积分数过高时，有一些醇溶黄酮类物质竞争，也造成了总黄酮得率的下降[94]黄酮得率最高。率的影响分数为 70%，提取时间为 1h,料液比为 1:70 不变的50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的温度提取接骨影响，结果见图 3-2。

黄酮,总黄酮,温度,接骨木

Fig. 3-2 Effect of temperature on the yield of flavonoids总黄酮得率的整体趋势，当温度从 40℃增加到 70达到 4%左右，可能因为温度较低时溶剂的溶解能，所以当温度增大，分子热运动剧烈，细胞膜的通但当温度从 70℃增加到 90℃时，总黄酮得率反而类物质的结构，反而使总黄酮得率降低，由此可知率的影响数为 70%，温度为 70℃，提取时间为 1h 不变的前提0:1、50:1、60:1、70:1、80:1 的料液比提取接骨木的影响，结果见图 3-3。

黄酮,总黄酮,温度,接骨木

图 3-2 温度对黄酮得率的影响Fig. 3-2 Effect of temperature on the yield of flavonoids黄酮得率的整体趋势，当温度从 40℃增加到 70℃到 4%左右，可能因为温度较低时溶剂的溶解能力所以当温度增大，分子热运动剧烈，细胞膜的通透当温度从 70℃增加到 90℃时，总黄酮得率反而降类物质的结构，反而使总黄酮得率降低，由此可知率的影响为 70%，温度为 70℃，提取时间为 1h 不变的前提下:1、50:1、60:1、70:1、80:1 的料液比提取接骨木叶影响，结果见图 3-3。

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