低离子浓度对1,3-丙二醇合成影响及代谢改造研究

发布时间：2020-09-27 19:18

　　 1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PDO)是新型纤维聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的合成单体,也是食品、化妆品、制药中使用的重要化学中间体,具有巨大的市场价值。克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)是一株优良的天然1,3-PDO合成菌株,但生产过程中存在发酵液离子(盐)浓度高、污染环境、发酵液腐蚀设备及下游提取分离成本高等问题,限制了1,3-PDO工业化生产。因此,本研究通过培养基优化降低发酵液离子(盐)浓度,弱化副产物合成、强化TCA循环提高K.pneumoniae的生长和1,3-PDO合成能力,尝试低离子发酵产1,3-PDO技术路线,旨在减轻下游提取分离过程中的脱盐压力。为降低发酵液离子浓度,尝试去除培养基中的两种主要阴离子PO_4~(3-)和SO_4~(2-),以减少发酵结束时有机盐和无机盐的产生。发酵结果显示,当培养基中PO_4~(3-)缺失时,菌株的生物量和1,3-PDO产量降低了47.8%、63.9%,副产物的积累量均有所提高;当培养基中SO_4~(2-)缺失时,副产物积累量未有明显变化,但菌株的生物量和1,3-PDO产量分别下降了10.1%和8.73%;培养基中同时缺失PO_4~(3-)和SO_4~(2-)时,菌株的生物量仅为原来的31.7%,而1,3-PDO产量降低了92.6%,仅为1.4 g·L~(-1)。尝试采用玉米浆或(NH_4)_2HPO_4来替代培养基中的KH_2PO_4、(NH_4)_2SO_4和MgSO_4,于发酵培养基中添加不同浓度的玉米浆或(NH_4)_2HPO_4后进行摇瓶发酵,发现1.5 g·L~(-1)的(NH_4)_2HPO_4基本满足要求,使培养基中初始盐的添加量降低了87%,但1,3-PDO产量和生物量有明显下降。为了提高低盐下的1,3-PDO产量,研究通过强化TCA循环,于K.pneumoniae中分别单独和共同过表达内源的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶编码基因ppc和来源于Escherichia coli突变后的柠檬酸合成酶编码基因gltA_(R164L),结果显示,单独过表达ppc或gltA_(R164L)能够分别增加TCA循环还原和氧化分支的碳流,但是并不能提高菌株的1,3-PDO产量,而共表达ppc和gltA_(R164L),使K.pneumoniae PG的1,3-PDO产量提高了10.2%。副产物合成和还原力供给是限制1,3-PDO合成的两个重要因素,因此,在敲除poxB、pta-ackA及ldhA基因阻断甘油氧化途径两个主要副产物乙酸和乳酸合成及敲除TCA循环溶氧响应调节蛋白编码基因arcA的菌株中共表达ppc和gltA_(R164L)以提高低离子浓度下菌株的1,3-PDO产量,结果表明,K.pneumoniae MPG的生物量、1,3-PDO产量分别增加了35.8%、8.22%;进一步过表达来源于E.coli中TCA循环的NAD(P)H合成酶,异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶,所构建K.pneumoniae MPGSLI的NADH和NAD~+总量提高了55.3%,NADH/NAD~+比例提高了39.5%,菌株的生物量和1,3-PDO产量分别增加了34.2%和8.4%,最终的1,3-PDO产量达到了21 g·L~(-1)。上述研究结果表明弱化副产物合成、强化TCA循环可以提高低离子发酵的菌株生长和1,3-PDO合成能力,为降低下游提取分离成本和工业化生产提供了思路。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ223.162
【部分图文】：

化学法

醇的性质与工业价值，由于化石燃料的枯竭、环境问题和可持续发展，可再生原料diol，1,3-PDO)的生物转化吸引了越来越多的关注。1,3-PDO 醇，具有无色、无臭、可与水和乙醇等有机溶剂混溶的性质；其药中使用的重要化学中间体[1, 2]，也是 GRAS(Generally Recogn的组成成分。,3-PDO 主要用作聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的合成单体。作T 兼具腈纶、尼龙、涤纶的优异性能，加上其固有的弹性，以特点[1]，成为了当前世界范围内的热门高分子新材料之一，并均有所应用。而随着 PTT 市场需求的增加，1,3-PDO 的市场也越全球 1,3-PDO 市场的复合年增长率为 10.4％，到 2021 年市[2]。因此，对 1,3-PDO 的研究具有十分重要的意义。成法生产 1,3-丙二醇

流程图,分离提取,发酵液,流程

江南大学硕士学位论文换工艺实验，确定了阳离子交换树脂在前、阴离子交换树脂在后通过静态吸附和动态脱盐实验探究了不同的离子交换树脂在 1盐效果，发现 001×7 号最佳，并且完全可以用于生产。孙沛勇等除 1,3-PDO 发酵液中盐成分的工艺参数，发现阴阳树脂装填比1 和 7:1，物料流速是树脂体积的两倍时，脱盐效果最佳。

调节子,操纵子,失活,基因

19图 3-2 Pi的信号转导机制(a)：PSTSCAB 和 PHOR 失活；(b)：PSTSCAB 和 PHOR 被激活Fig. 3-2 Pisignal transduction mechanism(a): Inactivated PSTSCAB and PHOR; (b):Activated PSTSCAB and PHO码2,3-BDO合成路径的 bud操纵子基因是 PHO调节子的一部分了证明这一猜想，分别测定了 K. pneumoniae 在原始培养基和无

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