大分子底物适用性立体选择性羰基还原酶的挖掘及其催化特性表征

发布时间：2020-10-13 18:00

　　 光学活性手性醇已被公认为合成精细化学品和药物的关键手性中间体,羰基还原酶催化还原潜手性羰基化合物具有高化学选择性、对映体选择性和区域选择性,是制备手性醇的单一对映异构体的有效方法。然而,工业中使用的大部分潜手性酮在结构上是复杂的,比如芳香酮、酮酯和杂环酮,底物分子大小引起的酶活性缺陷仍然是酶促还原酮的一个挑战。因此,有必要开发可催化还原具有庞大基团的底物的酶,用于生产高光学纯度的手性醇。本研究开发和构建了大分子酮还原酶工具箱,尝试以多种芳香酮、酮酯、杂环酮为底物,考察各酶的催化性能和立体选择性,实现了多种医药中间体的高立体选择性制备,并探究了 2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)和1-苄基-3-吡咯烷酮不对称转化反应的影响因素,具体研究内容如下:(1)通过基因挖掘获得新型醛酮还原酶,包括来源于Candida albicans的CaCR、来源于Saccharomyces cerevisiae ScCR 以及来源于Kluyveramyces marianus的 KmCR,同时挖掘到来源于C.parapsilosis的醛酮还原酶CPR-C1和CPR-C2。构建重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-CaCR、E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-ScCR、E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-KmCR,通过IPTG诱导使目的蛋白活性表达,构建大分子酮还原酶工具箱。除此之外,羰基还原酶RCR的两种突变体F285A/W286A和W116A,也作为本研究的大分子酮还原酶工具箱中的成员。通过对各羰基还原酶进行Ni亲和层析柱纯化,获得SDS-PAGE显示单一条带的纯酶。(2)以芳香酮、酮酯和杂环酮类化合物作为底物,考察大分子酮还原酶工具箱的催化性能。结果显示,各羰基还原酶均对一到几种大分子底物具有活性,与其他酶相比,ScCR显示出更广泛的底物特异性。大部分酶都具有潜在催化还原苯甲酰甲酸乙酯的能力。对与底物亲和力相关的Kn值分析,发现酶作用大分子底物的催化规律。(3)探究重组羰基还原酶的立体选择性,结果显示酶促反应生成的手性醇构型与其在工业应用上的需求相一致,以大于99%的对映体过量值生成(R)-扁桃酸甲酯、(R)-扁桃酸乙酯、(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯((R)-HPBE)、(5)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯以及(5)-1-苄基-3-吡咯烷醇。(4)分别探究反应体系组成和条件对OPBE、1-苄基-3-吡咯烷酮不对称转化反应的影响。结果显示以F285A/W286A催化还原OPBE时,当pH 7.0,反应温度30℃,3.5%(v.v-1)异丙醇作助溶剂,加入1 g.L-1底物,反应12h时,产率为80.3%,对映体过量值大于99%。而以W116A催化还原1-苄基-3-吡咯烷酮时,当加入60%(v·v-1)异丙醇、0.5 g.L-1底物时,产率为75.2%,对映体过量值大于99%。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ925
【部分图文】：

线菌和微藻类实现了一些ａ－酮酯和糸酮酯的微生物还有高转化率和优异的立体选择性［３７，３＇??作为光学活性物质，是重要的精细化工中间体和药物中生物是合成环扁桃酯、羟苄唑、匹莫林等血管扩张剂、间体。高炳学等人采用实验室筛选到的酿酒酵母ＬＨ，合成（／？）－（－）－扁桃酸甲酯产率为９４．３％，对映体过量值为ｌ．Ｌ－１［４２］。??０??ｆ??ｊ?Ｉ?〇ｒ??图１－１苯甲酰甲酸甲酯的还原??Ｆｉｇ．１－１?Ｔｈｅ?ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍｅｔｈｙｌ?ｂｃｎｚｏｙｌｆｏｒｍａｔｅ??酯是有机合成中重要的手性砌块，是环丙烯酸酯、氢化，用于立体化学研究［４３］。底物苯甲酰甲酸乙酯因与丙化还原的底物。ＭＵａｇｒｅ等人采用经藻酸钙纤维和双层ｒｅｖ／．ｙ／ｆｌｅ将苯甲酰甲酸乙酯成功还原为（７？）－扁桃酸乙醋，］。??

用于立体化学研究。底物苯甲酰甲酸乙酯因与丙酮酸微生物催化还原的底物。ＭＵａｇｒｅ等人采用经藻酸钙纤维和双层凝ｍｊＦｃｅｓ＇ｃｅｒｅｖ／．ｙ／ｆｌｅ将苯甲酰甲酸乙酯成功还原为（７？）－扁桃酸乙醋，产率％？９７％１４４］。??１?〇?ｆ??ｒ?ｔ?Ｉ?￣￣ｒ??图１－２苯甲酰甲酸乙酯的还原??Ｆｉｇ．?１－２?Ｔｈｅ?ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｔｈｙｌ?ｂｅｎｚｏｙｌｌｏｒｍａｔｃ??羟基－４－苯基丁酸乙酯（（／？＞ＨＰＢＥ）作为血管紧张肽转换酶（ＡＣＥ）抑制，可用于治疗高血压，比如西拉普利、依那普利、贝那普利、雷米普４１＾。（／？＞丨丨ＰＢＥ可通过２－氧代－４－苯基丁酸乙酯（ＯＰＢＥ）的不对称还原来等人利用各种不同微生物催化还原ＯＰＢＥ，利用Ｓ?合成了⑶－最値９５％；利用Ａ７ｗ＿ｙｖｅｒａｍｙｃｅｓ?以３２％的对映体过最值合＜；］。后又筛选到一株毕赤酵母能够不对称还原ＯＰＢＥ，生成（幻－ＨＰＢＥ，对映体过量值８１％｜ｌ１６］。丨兒晔等人通过从霉菌和６２种酵付中筛选ＭｉＷ２０２６作为高效催化剂，底物浓度２．５?ｇ．Ｌ＇对映体过量值９９．７０丨。??

?第一章绪论氟西汀、托莫西汀、尼索西汀是一类治疗抑郁症的重要药物，可以专一性抑体内去甲肾上腺素和５－羟色胺的吸收［５ｋ?５２１，?（Ｑ－３－羟基－３－苯基丙酸乙酷纪其合成的中间体，（５＞３－羟基－３－苯基丙酸乙酯的合成方法之一是苯甲酰基乙酸乙酯的不对原。Ｈ．?Ｅｎｇｅｌ?ｋｉｎｇ范人构建＿Ｔ?一株同时表达Ｘ?ｃｅｒｅｖ／ｈａｅ的脂肪酸合成酶和??的葡萄糖脱氢酶的Ｓ．?ｃｅｒｅｖ加此，催化还原苯甲酰基乙酸乙酯生成（５＞３－羟苯基丙酸乙酯。该转化反应在０．５?Ｌ的搅拌槽中进行，底物浓度５５?ｍｍｏｌ＋?Ｌ＇反应ｈ，产率为７４％，对映体过量值达到９７％１５３＇５４１。??
【参考文献】

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本文编号：2839507