乳酸菌高密度规模发酵工艺优化

发布时间：2020-10-14 08:28

　　 随着人们对抗生素滥用的重视,益生菌越来越广泛地应用于饲料、食品和医药行业,乳酸菌作为一种微生物资源因此受到越来越多的关注。乳酸菌高密度规模发酵是为提高菌体的发酵密度而使用的技术手段和特殊的培养装置,使菌体密度相较于普通培养方式能有显著的提高,最终提高菌细胞的产出率的一种扩大培养方式。在实际生产过程中,乳酸菌菌体密度是乳酸菌发酵产品的重要指标。本试验以嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌为研究对象,筛选适合其增殖的培养基,研究适合乳酸菌的培养条件,优化乳酸菌中试高密度发酵工艺以及冷冻干燥保护剂组成。本文的研究结果如下:(1)两株乳酸菌的形态学特征乳酸乳球菌在MRS培养基上可以形成明显的白色菌落,直径在1mm左右,圆形边缘整齐,不透明,表面光滑无皱褶。在添加碳酸钙的固体培养基中,菌落周围由于产酸形成透明的水解圈。显微镜下观察,细菌成球形,不形成链状。嗜酸乳杆菌在MRS培养基上可以形成明显的菌落。菌落圆形、白色、凸起,表面光滑、边缘较光滑,直径在1mm左右。在添加碳酸钙的固体培养基中,菌落周围形成透明水解圈。在显微镜下观察,细菌成短杆状。两株乳酸菌通过革兰氏染色均为紫色,是革兰氏阳性菌。(2)乳酸菌培养条件前期发酵条件优化前期实验室工作通过对两株乳酸菌的条件优化摸索,确定了以乳清粉为中试培养基,并确定乳酸乳球菌的最适培养温度在37℃C左右、初始培养基pH值在6.5、接种量在2%-7%之间,而接种量对最大活菌数的影响并不显著。培养28h可获最多的活菌,最大活菌数为 1.92±0.15×108CFU/mL;嗜酸乳杆菌的最适培养温度在37℃C左右、初始培养基pH值在6-6.5、接种量在5%-7%之间。嗜酸乳杆菌在乳清粉培养基中培养32h可获得最大活菌数为1.53±0.15 × 1 08 CFU/mL。(3)高密度规模化发酵工艺优化随着乳清粉含量的增加,通过离心获得的乳酸菌干重是不断增加的。当乳清粉含量增加至60%时,细胞干重(DCW/L)增加至13.21 g/L。通过乳清粉的添加,可以显著提高发酵罐中乳酸菌的细胞干重。而从菌粉获得率计算,当乳清粉含量增加至60%时,嗜酸乳杆菌获得率增加至23.42%。(4)冷冻干燥保护剂优化通过对离心获得的菌体添加10%的脱脂奶粉和10%的葡萄糖,或添加10%脱脂奶粉和10%海藻糖能够达到较高的复苏率。通过进一步筛选得到四种具有显著保护性能的保护剂,并通过对乳酸乳球菌冷冻干燥保护剂的四因素三水平正交实验,结果得出这四种因素对于冷冻干燥后复苏率的影响,从大到小的顺序依此是葡萄糖硫酸锰脱脂奶粉海藻糖。这四个因素对于冷冻干燥后的复苏率的影响都是极显著的,是影响该实验结果的主要因子。通过正交实验,确定了一种冻干保护性较强的冻干保护剂组合,这种冻干保护剂配比为每公斤菌体添加葡萄糖90g、海藻糖90g、硫酸锰60g、脱脂奶粉30g。冷冻干燥后的菌粉在储藏时应保持低温的环境,本次实验制备的两种菌粉在-20℃C环境下密封保存4周后,存活率仍能超过50%。(5)乳酸菌耐受实验两株冻干菌粉对于人工消化液均有一定的耐受能力,乳酸乳球菌在人工胃液中模拟消化3h存活率9.3%。在人工肠液中,经过4h的模拟消化过程,乳酸乳球菌的存活率为8.6%。以活菌数计算,通过7h的模拟消化过程,仍有超过108CFU/g的活菌数;而嗜酸乳杆菌菌粉相对于乳酸乳球菌对于人工胃液的耐受能力更稳定,经过3h的人工胃液模拟消化,由3.64×1010CFU/g下降到5.9×109CFU/g,存活率为16.3%。在人工肠液中,经过4h的模拟消化过程,嗜酸乳杆菌的存活率为2.3%,经过7h的模拟消化过程,嗜酸乳杆菌菌粉的活菌仍能超过108CFU/g。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ920.6
【部分图文】：

改进培养方式，提高活菌量。同时，对发酵结束后的菌体通过高速离心、真空??冷冻干燥的方法制成菌粉，并对冻干过程中需要添加的干燥保护剂类型进行研宄，通过实??验室的初步实验、企业生产前的中试，得出两株乳酸菌菌剂的最佳生产条件（图１－１）。??

图２－１乳酸乳球菌的菌落形态（Ａ）和革兰氏染色后的镜检照片（Ｂ）??Ｆｉｇ．?２－１?Ｃｏｌｏｎｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?（Ａ）?ａｎｄ?ｃｅｌｌ?ｍｏｉｐｈｏｌｏｇｙ?ｕｎｄｅｒ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ?ａｆｔｅｒ?Ｇｒａｍ?ｓｔＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ?ｌａｃｔｉｓ?ｓｕｂｓｐ．?Ｌａｃｔｉｓ??乳酸乳球菌在ＭＲＳ培养基上培养４８ｈ后，可以形成明显的菌落。菌落呈白色，

?落较小，直径在ｌ－２ｍｍ之间，圆形边缘整齐，不透明，表面光滑无皱褶，在添加碳酸钙??的固体培养基中，菌落周围形成透明圈（图２－１Ａ）。对液体培养基中的乳酸乳球菌染色后??在油镜下观察，细胞成球形，不形成链状（图２－１Ｂ）。??２．３．１．２培养时间??将活化后的乳酸乳球菌以２％的接种量，分别接种在装有ｌＯＯｍＬ?ＭＲＳ液体培养基的??２５０ｍＬ三角瓶中，３７°Ｃ静置培养，每４ｈ测定６００ｎｍ处的ＯＤ值，由此获得乳酸乳球菌生??长曲线。??由乳酸乳球菌的生长曲线（如图２－２）可以看出，该株乳酸乳球菌在８－２４ｈ时ＯＤ值??增长迅速，在２４ｈ后趋于稳定，若出于获得最大活菌数的目的，应在２８－３２ｈ之间进行菌??体收集。??１．０?ｒ??０．９??０．８??Ｍ?＊?Ｍ??０７??！?°．６?／??ｇ?０．５?－?Ｖ??°４??〇?３?．??０．２?＾??０．１??〇〇??ｉ??．１?１?Ｉ?ｉ??Ｉ?１?Ｉ?１?Ｊ??０?４?８?１２?１６?２０?２４?２８?３２?３６?４０?４４??时间（ｈ）??图２－２乳酸乳球菌的生长曲线??Ｆｉｇ．２－２?Ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?Ｌａｃｌｏｃｏｃｃｕｓ?ｌａｃｔｉｓ?ｓｕｂｓｐ．?ｌａｃｔｉｓ??２．３．１．３发酵温度??通过对乳酸乳球菌生长曲线的测定，确认乳酸乳球菌的对数生长期结束时间为２８ｈ，??稳定期在２８－３２ｈ之间。随后，通过设定２５、３０、３５、３７和４０?°Ｃ等不同培养温度。以同样??２％的接种量将活化后的乳酸乳球菌分别接种至初始ｐＨ值为６．５的１００?ｍＬ?ＭＲＳ液体培养??基中
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本文编号：2840424