表达蛋白酶的米曲霉工程菌构建及发酵特性研究

发布时间：2020-10-17 04:57

　　 丝状真菌米曲霉是发酵工业的重要菌种,具有良好的蛋白分泌能力和较高的食品安全性。本研究应用分子生物学技术,重组构建了5株新型米曲霉工程菌,将其应用于豆粕原料的发酵,比较和研究了外源蛋白酶基因的导入对米曲霉发酵作用的影响,并对菌株所表达的外源蛋白酶进行了分离纯化及酶学特性的研究。研究结果对于以米曲霉为宿主的外源基因的转化和调控,以及米曲霉优良菌株的选育具有重要的意义。本研究首先应用PCR扩增的方法从地衣芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和黑曲霉中扩增到了3个碱性蛋白酶基因和3个酸性蛋白酶基因。运用生物信息学的方法对蛋白酶基因进行序列分析和氨基酸序列预测。以双元表达载体pCAMBIA1304为载体骨架,通过连入米曲霉高效表达元件淀粉酶启动子和糖苷酶终止子构建米曲霉表达阅读框。在表达阅读框中分别连入单个外源蛋白酶基因,构建了4个表达载体paa-subC、paa-asp、paa-Ap、paa-pep。采用以自剪切肽(T2A肽)作为连接的策略,将两个碱性蛋白酶基因subC和asp连入表达载体中,构建了碱性蛋白酶串联表达载体paa-sTa,以研究多顺反子载体在米曲霉中的表达情况。丝状真菌遗传转化系统较为复杂,相同的转化方法在不同种属间的转化效率差别较大,甚至在不同亚种之间也会有很大差异。本研究对米曲霉的遗传转化体系进行了研究,应用根瘤农杆菌介导的方法转染米曲霉,以潮霉素作为筛选标记,并对影响转化效率的米曲霉孢子浓度、农杆菌菌液浓度、共培养时间、共培养温度等条件进行优化,建立了根癌农杆菌介导的米曲霉遗传转化体系。结果显示在预培养时加入诱导剂乙酰丁香酮可显著提高转化效率,当根瘤农杆菌的OD_(600)为0.6,米曲霉孢子浓度为10~7/m L个孢子,28℃时共培养3d,转化效率最高。验证结果显示外源目的基因已成功导入米曲霉基因组中,说明根瘤农杆菌介导的方法可以应用于米曲霉转化系统,研究结果为米曲霉的遗传转化提供了新的途径,对曲霉类丝状真菌的遗传转化具有一定的借鉴作用。利用构建的米曲霉重组工程菌发酵底物豆粕,考察不同菌株发酵的蛋白酶活力、多肽转化率、发酵产物分子量组成及抗氧化活性。研究结果显示外源蛋白酶基因的导入可显著提高米曲霉工程菌的蛋白酶活力,其中米曲霉asp碱性蛋白酶活力为165U/mL,与野生型米曲霉相比提高了140%;米曲霉pep的酸性蛋白酶活力为143U/mL,比野生型提高了242%。改造后的工程菌对原料的水解效率和多肽产品的转化率也有所提高,米曲霉pep的多肽转化率达到35.89%,为野生型的2倍。发酵产物氨基酸含量分析结果显示不同菌株发酵产品中游离氨基酸总量、必需氨基酸总量均存在差异。发酵豆粕SDS-PAGE电泳分析及扫描电镜观察结果显示,基因工程改造可加强菌株对底物的水解作用。应用超滤及凝胶过滤的方法,对不同工程菌发酵豆粕后的产物进行分离,并对分离后的各组分的抗氧化活性进行比较。结果显示米曲霉pep发酵获得的小分子肽比例较大;与野生型米曲霉发酵产物相比,各工程菌发酵产物不同组分的抗氧化活性均有不同程度提高,其中米曲霉pep发酵产物组分Ⅰ抗氧化活性较好。为进一步提高菌株发酵性能,应用响应面法对米曲霉pep发酵豆粕产多肽的条件进行优化,结果显示当发酵时间为108h,发酵温度31℃,接菌量为8%时,多肽转化率达40.4%。选取蛋白酶活力相对较高的米曲霉工程菌asp和米曲霉pep,应用硫酸铵盐析、DEAE阴离子交换层析和葡聚糖凝胶层析对所表达的碱性蛋白酶ASP和酸性蛋白酶PEP进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了初步研究。电泳结果显示重组碱性蛋白酶分子量约为31 kD,重组酸性蛋白酶分子量约为40 kD;两种酶的纯化倍数分别为5.64倍和3.85倍,分别对纯化的两种蛋白酶的酶学性质进行了研究。所获得结果对于利用米曲霉作为外源基因表达的细胞工厂,探索外源基因在米曲霉中的转化、表达和调控具有一定的参考价值。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ925
【部分图文】：

图 1-2 2A 肽在多顺反子载体构建中的裂解机制Fig.1-2 Mechanism of self-processing of 2Apeptide in construction of polycistron expression vect

微生物蛋白酶.1 微生物蛋白酶的分类蛋白酶的主要作用是催化蛋白质水解，在水解底物大分子时获得小分子的微生物蛋白酶作为蛋白酶的主要来源被广泛研究。按照酶切位点的不同，蛋白酶分为内肽酶和外肽酶；根据催化机制的不同又可将微生物蛋白酶分酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶。目前较广泛的是按同将其分为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶(Sabotic，2012)。.2 碱性蛋白酶图 1-3 不同 2A 肽的 DNA 序列及其相应氨基酸组成Fig.1-3 DNAand corresponding amino acid sequences of various 2Apeptides

2.2.1 碱性蛋白酶基因扩增的结果2.2.1.1 地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因 subC、aprB 扩增的结果从地衣芽孢杆菌细胞中提取基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2-1所示，所提取DNA质量较好，可以作为PCR扩增的模板使用。以地衣芽孢杆菌细胞基因组DNA为模板，PCR扩增subC基因，结果如图2-2所示，通过扩增在1000-2000bp之间获得一DNA条带，大小如文献相符，将其回收后与测序载体连接进行测序。同样方法获得的aprB基因片段如图2-3所示，其大小与预期基因大小一致，回收后测序。1500025001000250M 1 2图 2-1 地衣芽孢杆菌基因组 DNA 检测结果Fig.2-1 Result of Bacillus lich
【参考文献】

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本文编号：2844307