纤维素水解液耐受性裂殖壶菌产DHA及甾醇的研究

发布时间：2020-10-17 18:20

　　 二十二碳六烯酸(DHA)属于ω-3不饱和脂肪酸,对婴幼儿的脑部和视网膜发育极为重要。木质纤维素来源丰富且环保,分布广泛,价格低廉,木质纤维素作为可再生及环保的新能源是未来能源利用和开发的一个趋势。本文以裂殖壶菌Aurantiochytrium sp.FJU-512为出发菌株,建立了裂殖壶菌常温常压等离子体(ARTP)诱变及自然驯化的方法,获得了对木质纤维素水解液抑制物高耐受性和高产DHA的菌株。在此基础上,对裂殖壶菌突变株在甘蔗渣水解液培养基中培养进行了摇瓶条件优化以及5L发酵罐的发酵条件优化。同时,对突变菌株与原始菌株进行了转录组学分析以阐述突变株的耐受机制。最后,为获得新的功能性化合物,对裂殖壶菌的胞外产物进行分离、纯化以及结构鉴定。本文建立了甘蔗渣水解液平板驯化以及ARTP诱变后利用水解液平板作为筛选培养基的方法。通过甘蔗渣水解液平板自然驯化获得突变株Aurantiochytrium sp.FN-21,以葡萄糖为碳源培养时,DHA的产量由5.38 g/L提高到了6.5 g/L,提高了20.8%,甘蔗渣水解液培养时,DHA产量由1.23 g/L提高到了2.46 g/L,提高了 100%。通过ARTP诱变获得突变株Aurantiochytrium sp.FNA8,DHA产量由5.38 g/L提高到了 6.56 g/L,产量提高了 21.9%,甘蔗渣水解液培养时由1.23 g/L提高到了2.36 g/L,提高了91.9%。为了进一步提高DHA的产量,进行了氮源的优化,确定了以Aurantioc-hytrium sp.FNA8为出发菌株在甘蔗渣水解液添加22 g/L的玉米浆粉,最终DHA的产量达到了5.08 g/L。最后,利用5 L罐上进行验证及进一步优化,以稀释一倍的水解液作为初始培养基培养24 h后补料发酵,最终DHA产量达到了 8.63 g/L。裂殖壶菌利用纤维素水解液生产DHA具有很高的工业应用价值。本文对突变株Aurantiochtrium sp.FN21和原始菌株Aurantiochytrium sp.FJU-5-12在水解液中培养至对数前期和对数期的菌取样测序,进行RNA-seq转录组学分析。发现在TCA循环、氨基酸的生物合成、脂肪酸代谢和芳香族化合物的降解等四个代谢过程中的一些基因转录水平发生了显著上调,分析这些途径可能与Aurantio chytrium sp.FN21的纤维素水解液耐受性有关。选取无蛋白胨、酵母膏的培养基进行裂殖壶菌的200 L罐发酵,发酵液通过离心、萃取获得了9g粗提液。粗提液利用正相硅胶柱、反向硅胶柱和凝胶柱进行分离,最终获得5种化合物。利用质谱进行物质结构的分析和鉴定。选取其中一种可能具有研究价值的甾醇类进行1H谱和13C NMR谱等推测该化合物为(E-17-(5-ethly-6-methylhept-3-en-2-ly)-10,13-dimethyl-1,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-do-decahydro-2H-5,8-epidloxycyclopenta[a]phenanthren-3-ol。该化合物分子式为 C29H46O3,分子量442.67,是海洋微生物次级代谢产物中有价值的一种甾醇。
【学位单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ929
【部分图文】：

?福建师范大学硕士学位论文???菌种的改造和发酵条件的优化是提高微生物中目标产物较为常用的方法，菌种??的改造主要集中在传统的诱变以及对菌株进行基因工程的改造方面。许永等利用紫??外诱变结合喹禾灵筛选的方法使裂殖壶菌种ＤＨＡ的产量提高了?１３．４％１＠。由于裂??殖壶菌是真菌，基因工程改造存在一定的难度，目前通过基因工程改造裂殖壶菌的??报道较少。Ｘｉａｏｙａｎ?Ｚｈｕａｎｇ等利用电转将Ｇ４１８抗性和ｂｌｅ基因成功导入裂殖壶菌中，??但ＤＨＡ产量未明显改变＿。发酵后期低Ｃ／Ｎ比、低温、低转速均有利于ＤＨＡ的??产生，因此裂殖壶菌发酵条件的优化主要集中在前期碳源持续的供给、后期氮源的??持续补加、后期低温和低转速等方面［３１１。??

经过一系列的还原、缩合反应生成棕榈酸（Ｃ１６：?０），棕榈酸在一系列的延长酶和??去饱和酶的作用下生成ＤＨＡ。而细菌等原核生物中的长链多不饱和脂肪酸通常采用??厌氧聚酮合酶（ＰＫＳ）途径合成１２８］。如图３所示，脂酰－ＡＣＰ和丙二酸单酰－ＡＣＰ在??厌氧条件下经过一系列的缩合，加氢，还原，脱氢等反应最后生成ＤＨＡ。本文以裂??殖壶菌作为ＤＨＡ发酵菌株，一般认为裂殖壶菌中ＤＨＡ和ＤＰＡ由ＰＫＳ途径合成，??而其他的短链脂肪酸由ＦＡＳ途径合成％。陈伟等利用了浅蓝菌素对ＦＡＳ途径的不??可逆抑制，分别在甘油和葡萄糖中培养，确定了裂殖壶菌中存在的ＰＫＳ和ＦＡＳ途??径均可以合成ＤＨＡｔ２７］。??１．４裂殖壶菌中ＤＨＡ产量的优化??－３－??

以木质纤维素为原料生产微生物油脂的生物炼制技术??随着社会的发展，石油、天然气和煤等化石资源的大量开采用于制备燃料和品。导致自然资源消耗殆尽，环境污染难以治理，所以发展可再生的能保护环新能源迫在眉睫１３２］。木质纤维素来源丰富，分布广泛，价格低廉，生成过程中收Ｃ〇２有利于保护环境。所以木质纤维素的利用和开发来代替化石能源获得了的关注。??２．１木质纤维素??木质纤维素主要由木质素，纤维素和半纤维素组成，一般来说纤维素比０％－６０％、半纤维素为２０％－４０％、木质素为１５％－２５％，还有少量的灰分、矿物构蛋白等物质［３３１。木质纤维素的种类众多，如下图四所示：有甘蔗渣，玉米棒稻草秸杆等１Ｗ。??
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本文编号：2845157