乳酸杆菌γ-氨基丁酸合成能力的强化研究

发布时间：2020-10-23 09:54

　　 作为哺乳动物中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质,γ-氨基丁酸(GABA)具有降血压、健肝利肾、增强记忆、促进睡眠等多种生理功能,在食品、医药、化工等行业具有广泛用途。通过乳酸菌发酵生产GABA以满足其日益增长的商业需求是人们的普遍共识,了解乳酸菌谷氨酸脱羧酶(GAD)系统基因表达情况,并通过代谢工程、蛋白质工程和发酵调控等手段提升乳酸菌GABA生产性能具有重要意义。本研究首先以GABA高产菌株Lactobacilaus bbrevis CGMCC1306为研究对象,解析了在不同培养条件下菌株GAD系统关键基因的表达差异;其次,克隆了植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GAD(具有相对较宽pH催化活性范围)基因并对其进行分子改造,获得了在近中性pH条件下仍具有较高催化活性的突变体GadBC378S,并将该突变酶在Lb.brevis CGMCC1306中过表达,提高了菌株的GABA合成能力。论文主要研究结果如下:(1)以Lb.brevisCGMCC1306为研究对象,在外源添加二环己基碳二亚胺(DCCD)弱化细胞F1Fo-ATPase酶活的情况下,考察菌体生长代谢情况和其GAD系统中关键基因gadA、gadB和gadC的转录水平。结果表明:不同程度弱化F1Fo-ATPase活性会导致该菌菌体生长受到不同程度的抑制,且高浓度DCCD会导致细胞裂解死亡;采用低浓度的DCCD适当抑制F1Fo-ATPase酶活可以加快Lb.brevisCGMCC1306在兼性厌氧条件下细胞内的糖酵解速率,并提高GAD系统关键基因gadB和gadC的表达水平(对数后期时较对照组分别提高25.09%和37.65%;稳定期时较对照组分别提高11.03%和32.5%),从而提高菌体细胞的GABA合成速率。(2)以获取具有相对较宽pH催化活性范围的Lb.plantarumGAD(GadB)为目标,采用溶钙圈法和目的基因PCR筛选法获得了两株具有GABA合成能力的植物乳杆菌Lb.plantarum GM1403与Lb.plantarum PF1409,然后克隆了这2个菌株的gadB基因,并以pET28a表达载体,分别在E.coli BL21(DE3)中进行了重组表达研究,实现了2个酶的可溶性表达。在此基础上,考察了这两个酶的酶学性质,发现两种酶最适温度和pH相同(分别为40 ℃和pH 5.0),但是来源于这两个菌株的GadB具有更宽广的pH催化范围:当pH值升高至5.6时,不仅仍具有催化活性,而且相对酶活高达34.5%,远高于其它乳酸菌源的GAD相对酶活。(3)为进一步提高Lb.plantarum GM1403 GadB在中性条件下的催化活力,本研究构建了截短C末端的GadB△11突变体并通过定向进化的方法获得了该突变体的突变文库,利用建立的高通量筛选法(基于pH敏感指示剂甲酚红的比色法),在近中性条件下筛选获得了一个较好的突变体C378S:该突变体在pH值为6和7时,酶活性分别是GadB△11的1.48倍和2.03倍。在最适反应条件下(pH 5.0,40℃,C378S 的Km 为 19.03 mM,且与 GadB△11 相似。在Lb.brevis CGMCC 1306中,利用乳酸菌组成型表达载体pMG36e对突变体C378S进行异源过表达,结果表明重组菌株Lb.brevis/pMG36e-gadBc378s经过36 h发酵,GABA的产量可以达到38.47 g/L,较对照组的产量提升了 24%。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ921.4
【部分图文】：

反向转运蛋白ＧａｄＣ将碱性物质ＧＡＢＡ与胞外的谷氨酸交换，而Ｇｌｕ／ＧＡＢＡ的??跨膜运输产生的电势差通过Ｆｆｏ－ＡＴＰａｓｅ可以生成一个ＡＴＰ。由此可见??Ｆｆｏ－ＡＴＰａｓｅ活性、ＧＡＤ活性、质子环境变化之间存在着紧密联系（图２．１）。??课题组前期研究表明，氧气是影响乳酸菌ＧＡＢＡ合成效率的关键因素；且??在兼性厌氧条件下，一定程度上弱化Ｆｆｏ－ＡＴＰａｓｅ活性可以促进乳酸菌细胞ＧＡＤ??活性的提升［１００］，但该过程对其ＧＡＤ系统相关基因表达的影响尚需进一步阐明。??短乳杆菌是乳酸菌中高产ＧＡＢＡ的常见菌种。通常，其ＧＡＤ系统含有两个谷氨??酸脱羧酶和一个Ｇｌｕ／ＧＡＢＡ反向转运蛋白，它们的编码基因分别被命名为职必、??和ｇａｄ，其中ｇｒｗ／Ｓ和ｇａｄＣ组成操纵子本章将以课题组从鲜牛奶??中分离得到的一株具有自主知识产权的ＧＡＢＡ高产菌株６ｒｅｖ＾ＣＧＭＣＣ?１３０６??为研究对象，选取ＤＣＣＤ作为Ｆｆｏ－ＡＴＰａｓｅ酶抑制剂，分析弱化Ｆｆｏ－ＡＴＰａｓｅ活??性对短乳杆菌的生长、糖酵解的影响

图２．６?ＤＣＣＤ对短乳杆菌生长的半数效应浓度测定??Ｆｉｇ?２．６?ＥＣ５０?ｏｆ?ＤＣＣＤ?ｔｏ?ｔｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ?Ｌｂ．?ｂｒｅｖｉｓ?ＣＧＭＣＣ１３０６??单位时间单位菌体消耗的葡荀糖量如图２．７所示。研究表明：葡荀糖代谢速??率随着细菌的生长时期延长而逐渐降低，这与不同时期细胞的生理活性相符合；??值得关注的是，相比于对照组，在对数生长中期（ＥＸＰ．；?１８?ｈ?）、对数生长末期（ＥＸＲ；??２４?ｈ）加入０．１７?ｍＭ?ＤＣＣＤ体系中的加ｅｖｋ?ＣＧＭＣＣ?１３０６细胞的葡萄糖代谢??速率分别增加４６．６７?％、１３?％；同时平衡期（ＳＴＡＴ．；?３０?ｈ）对照组体系中Ｚｒｏｖｂ??ＣＧＭＣＣ?１３０６细胞葡萄糖代谢十分微弱，而加入ＤＣＣＤ后菌体细胞葡萄糖代谢??明显活跃。这可能是弱化ＦｉＦｏ－ＡＴＰａｓｅ活性导致胞内ＡＴＰ水平降低，减少了?ＡＴＰ??对糖酵解中关键酶的抑制，且细胞为维持生理活性进而加速糖酵解途径从而获得??相应的ＡＴＰ供给，因而有效促进了糖酵解通量的增加。?＿??Ｓ?１０－１???ｔ．?Ｊ?［Ｚ＾?ＣＫ??艺?８－?■?■■?０．１７?ｍＭ?ＤＣＣＤ??＾?ｊ??■??！?Ｉ?ｉ?ｊ??１?Ｈ?．．．．．．Ｍ?Ｌ－Ｐ?－??＾?ＥＸＰ．；?１８?ｈ?ＥＸＰ．；?２４?ｈ?ＳＴＡＴ．；?３０?ｈ??ｏ??图２．７兼性厌氧条件下ＤＣＣＤ对短乳杆菌葡萄糖代谢的影响??Ｆｉｇ?２．７?Ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ＤＣＣＤ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ?ｆｌｕｘ?ｏｆ?Ｌｂ．ｂ

菌株ＧＭ４０３与ＺＡ?ＰＦ１４０９由本章筛选、鉴定并保??藏；载体ｐＥＴ２８ａ（＋），质粒图谱如图３．１，质粒全长为５３６９ｂｐ，具有卡那霉素抗??性。菌株克隆宿主Ｚ?ｃｏ／／ＤＨ５ｃｔ及表达宿主五．ｃｏ／ｉＢＬ２１（ＤＥ３）为本实验室保存；??氨基丁酸（ＧＡＢＡ）标准品、谷氨酸钠、酵母粉、胰蛋白胨、氯化钠、丹酰??氯（ＤＮＳ－Ｃ１）、溶菌酶、５〇ｘＴＡＥ缓冲液、硫酸卡那霉素（Ｋａｎ）、异丙基－ｐ－Ｄ－??硫代吡喃半乳糖苷（ＩＰＴＧ）、质粒提取试剂盒、ＰＣＲ产物纯化试剂盒、ＤＮＡ琼??脂糖凝胶回收试剂盒及超级感受态制备试剂盒购自上海生工；细菌基因组抽提试??剂盒购自天根生化科技有限公司（中国）；甲醇（色谱纯）购自Ｔｅｄｉａ公司；Ｔ４ＤＮＡ??快速连接酶购于北界全式金生物技术有限公司；ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ？Ｍａｘ??ＤＮＡ聚合酶及蛋白Ｍａｒｋｅｒ购自Ｔａｋａｒａ公司；限制性内切酶；Ｓｈ／?Ｉ和Ｉ购??自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司；Ｎｉ－ＮＴＡ?Ａｇａｒｏｓｅ购自Ｑｉａｇｅｎ；其他试剂均为国产分析纯。??Ｘｈｏ?ｌ｜１Ｓ８｝??Ｎｏｔ??Ｅａｇ?ｌ＂６６）??Ｈ？ｎｄ?ＩＩ（＜１７３）??Ｓａｌ??Ｓａｃ?Ｉ＜１９０）??ＥｃｏＲ?１１１９２）??ＢａｍＨ?Ｉｆｉｓａ）??，Ｂｐｕ１１０２１（８０）?Ｋ２３１｝??ｏｒａ?、?Ｌｒ＾＜＾?ｎＳＵＳＳ??１（３３５）??Ｓｐ＊１?＇ｆ５？８）??＼＼??—微?＼＼＾？，，功??Ｎｒｕ?ｆ（４０８３）?ｊ?１１?ｉＢｓ￡Ｅ?ｌｉ〇３〇４）??Ｖ?，（”?｜?卜，??＼?＇ｗ／ｆ／ＢｓｓＨ）ｌ（１５？）??ＥＣ０５７Ｋ３７７２Ａ?／?／
【参考文献】

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本文编号：2852879