高产酸性蛋白酶菌株筛选及酶解鱼溶浆制备氨基酸原液的工艺研究

发布时间：2020-10-25 06:27

　　 本研究筛选产酸性蛋白酶菌株,结合现代发酵技术,尝试通过研制氨基酸原液为进一步开发出新型氨基酸生物有机肥奠定基础,主要研究内容及结果如下:从鱼粉水解液中筛选得到一株产酸性蛋白酶菌株,通过形态学观察及26S rRNA序列分析,对该菌株进行鉴定,确定为毕赤酵母属,命名为Pichia galeiformis strain.Zju-C,采用MEGA7.0中的邻位相算法构建Zju-C菌26S rRNA基因系统进化树。为提高目标菌产酸性蛋白酶能力,采用紫外线和热处理等物理诱变手段对其进行选育研究。结果表明,复合诱变对提高目标菌的产酶性能有较为显著影响,并从众多正突变菌株中筛选出一株相对高产的优势菌株Pichia galeiformis strain.Zju-C UV-R2。相比于出发菌株,该菌延滞期缩短了 4 h,酶活可达到194.3±1.6 U/mL,为原酶活的1.61倍。通过单因素实验、Plackett-Burman设计确定了影响发酵产酶的三个显著因素:盐度、磷酸氢二钠浓度和硫酸镁浓度,利用最陡爬坡实验确定了响应面分析的中心点,最后通过响应面分析法对显著影响因子进行分析。确定最佳的培养基配方为(g/L):废糖蜜 50,豆粕粉 50,NaH2P04 11.55,硫酸镁 1.14,盐度 22.76,pH 5.0,接种量为3%。酶活理论预测值为390.7U/mL,实际酶活为391.6±2.3U/mL,两者十分相近,说明二阶回归模型具有良好的重复性和可靠性。在前期摇瓶实验的基础上,进行了 7.5L发酵罐的放大试验,在通气量为4 L/min、搅拌速度为400 r/min的条件下,以3%的接种量转接发酵24 h,最后粗酶液酶活达到419.4±4.5 U/mL。对粗酶液酶活性质进行了初步的研究,研究结果表明,在pH 3.5、45℃条件下,加入0.9 g/L锰离子可以使粗酶液蛋白酶酶活达到542.9±2.7 U/mL。以此为基础,对氨基酸原液进行初步的研制,经过7天酶解以及7.5L发酵罐的发酵放大,最后发酵液中氨基酸含量可提高至69.5±1.7mg/mL,比酶解前增加了 39%。其中酶解原料为鱼溶浆,鱼溶浆亦称水解鱼蛋白,其制法概括起来即是用酸、碱或酶将水产品肉蛋白进行部份或全部水解,使之成为可溶性蛋白质。经过成分检测分析,确定得到的氨基酸原液可以作为鱼蛋白有机液肥投入生产应用,并且对比氨基酸液肥标准,虽在氨基酸含量上略有不足,但是距离液肥的成功研制已非常接近。同时通过田间的简单试验,发现氨基酸原液的确具有较显著增强作物抗逆性的功效。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ440.22
【部分图文】：

最终成功分离到了?８株具有显著水解酪蛋白能力的产酸性蛋白酶菌??株。将这些菌依次命名为Ｚｊｕ－Ａ至Ｚｊｕ－Ｈ菌，并利用复筛方法进一步测定每种菌??株发酵液中的酸性蛋白酶酶活，结果如图２－１所示。??１６０?ｒ?ａ?ｉ?４．５??１４〇?［?Ａ?ｂ?＿?４?画酶话??￣？，ｎ?／?ｃｄ－?３．５?—ＨＣ值??？＃２０?，?ｄｅ／?Ｗ＼?ｆ??｜＼?ｆ｜?／?＊?３??ＶＭ??ｆ：?ＩＩＩ?ｌ?ｉｌ?１１１?ｒ??Ｚｊｕ－Ａ?Ｚ｜ｕ－Ｂ?Ｚ｜ｕ－Ｃ?Ｚｊｕ－Ｄ?Ｚｊｕ＞Ｅ?Ｚ｜ｕ－Ｆ?Ｚ｜ｕ－Ｇ?Ｚｊｕ－Ｈ??图２－１各菌种酶活和对应ＨＣ值的大小??Ｆｉｇ．?２－１?Ｅｎｚｙｍｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ａｎｄ?ＨＣ?ｖａｌｕｅ?ｏｆ?ｅａｃｈ?ｓｔｒａｉｎ??注释：图上标不同小写字母（ａ，?ｂ）表示差异迗显著水平（Ｐ＜０．０５）??Ｎｏｔｅｓ：?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｌｅｔｔｅｒｓ（ａ，?ｂ）?ｍｅａｎ?ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ?（Ｐ＜０．０５）??２０??

根据所测得各菌种发酵酶活的高低，结合相对应的菌落透明水解圈大小，最??终确定以Ｚｊｕ－Ｃ菌株作为出发菌种进行后续的试验研究，此时该菌的酶活为??１２０．８±２．３?Ｕ／ｍＬ，由其形成的菌落透明水解圈效果如图２－２所示。??＿??图２－２透明水解圈??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ?ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ?ｃｉｒｃｌｅ??２．４．２?Ｚｊｕ－Ｃ菌生长曲线绘制??由于Ｚｊｕ－Ｃ菌采用的分批培养模式，故实际的生长过程基本符合“倒钟型”??生长曲线特征，分别依次经历了迟滞期、对数期、稳定期、衰亡期等四个不同的??生长时期。从菌株的生长曲线图２－３不难发现，目标菌在培养１０ｈ后，呈现出明??显的指数式增长趋势。接近２８?ｈ时，生长的速度则逐渐的放缓，随即达到稳定??期，持续４个小时后进入衰亡期。总体而言，目标菌繁殖速度快，生长周期短，??完成一个生命周期只需３８ｈ左右，整个生长阶段遵循微生物一步生长规律。??３?－??２．５?－?１?１??Ｉ．?ｆ??０．５

根据所测得各菌种发酵酶活的高低，结合相对应的菌落透明水解圈大小，最??终确定以Ｚｊｕ－Ｃ菌株作为出发菌种进行后续的试验研究，此时该菌的酶活为??１２０．８±２．３?Ｕ／ｍＬ，由其形成的菌落透明水解圈效果如图２－２所示。??＿??图２－２透明水解圈??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ?ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ?ｃｉｒｃｌｅ??２．４．２?Ｚｊｕ－Ｃ菌生长曲线绘制??由于Ｚｊｕ－Ｃ菌采用的分批培养模式，故实际的生长过程基本符合“倒钟型”??生长曲线特征，分别依次经历了迟滞期、对数期、稳定期、衰亡期等四个不同的??生长时期。从菌株的生长曲线图２－３不难发现，目标菌在培养１０ｈ后，呈现出明??显的指数式增长趋势。接近２８?ｈ时，生长的速度则逐渐的放缓，随即达到稳定??期，持续４个小时后进入衰亡期。总体而言，目标菌繁殖速度快，生长周期短，??完成一个生命周期只需３８ｈ左右，整个生长阶段遵循微生物一步生长规律。??３?－??２．５?－?１?１??Ｉ．?ｆ??０．５
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本文编号：2855595