扭脱甲基杆菌AM1高产甲羟戊酸发酵工艺优化

发布时间：2020-10-27 20:54

　　 甲醇基微生物细胞工厂能够以甲醇为原料生产高附加值产品,在一定程度上可以解决“与人争粮”的问题。同时甲醇来源广泛,价格低廉,是非常好的生产原材料。因此开发甲醇基微生物细胞工厂具有非常重要的意义。为提高扭脱甲基杆菌生产甲羟戊酸(mevalonate,MEV)的产量,在摇瓶水平对其发酵工艺进行了优化。采用批次添加甲醇的策略来减小甲醇对菌体生长和生产MEV的抑制作用,并添加甲酸钠来提高细胞内还原力。得出最佳发酵条件为,1%初始甲醇浓度,开始培养后每24 h添加0.33%甲醇,在发酵120 h后添加20 mmol/L甲酸钠,MEV的产量为450.74 mg/L,比优化前提高了44.43%,细胞密度OD600值达到23.96,比优化前提高了86.46%,同时甲醇使用量相比优化前减少了33.3%。添加甲酸钠24 h后,相比不添加甲酸钠组细胞内还原力提高了61.85%,还原力提高是MEV增加的主要因素之一。在摇瓶优化的基础上,对1 L和5 L发酵罐水平上对其发酵工艺做进一步优化,在确定1%甲醇浓度为最佳起始浓度,对氮源的影响进行了定量研究,发现相对起始氮源的3倍氮源对菌体生长最佳,此条件下最高OD600值达到37.15;而相对起始氮源5倍氮源对MEV生产最佳,最高产量达到948.42 mg/L。在此基础上,对发酵过程中氮源进行流加,总氮源为原培养基氮源的5倍,采用恒速流加的方式进行流加,流加时间为4 d,最终OD600值达到41.5,MEV的产量达到1130 mg/L。在甲醇和氮源同时流加的基础上120 h添加20 mmol/L的甲酸钠,最高OD600值为42.43,甲羟戊酸产量为1450 mg/L本研究在摇瓶水平上得出最佳甲醇添加策略,添加甲酸钠解决了细胞内还原力不足的问题;在发酵罐水平上得出甲醇和氮源的最佳流加条件,提高了菌体浓度和甲羟戊酸的产量,为甲醇基细胞工厂生产高附加值产物的发展提供了基础。
【学位单位】：安徽工程大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ921
【部分图文】：

将其命名为假单胞菌ＡＭＩ?（ＰｓｅｗｃｆｏｗｏｍｗＡＭｌ），归属于ｙ变形菌纲（ｙ－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）??从１９８０ｓ开始，世界各国科学家对ＡＭＩ系统地展开了生理生化方面的研究，如??图１．２所示。??５??

教授课题组绘制了?Ｍｅｘｔｏｒ＾＾ｗＡＭｌ的Ｃ丨代谢图谱Ｉ”］。第二年，该课题组完成该菌??的全基因测序［３８］。２０１１年，法国的Ｊｅａｎ－ＣｈａｒｌｅｓＰｏｒｔａｉｓ课题组阐明了该菌的代谢网络［３９］，??如图１．３所示。??６??

安徽工程大学硕士学位论文??最后ＨＭＧ－ＣｏＡ在３－羟基－３甲基－戊二酸单酰辅酶Ａ脱氢酶（ＨＭＧＲ）的催化下生成甲??羟戊酸，中的甲羟戊酸合成具体途径如图１．５?（ａ）所示，在此过程??中每合成１分子甲羟戊酸需要消耗２分子ＮＡＤＰＨ。??（＞＞?ＭＥＶ?ＰＡＴＨＷＡＹ?（ｂ＞??Ｍｅｔｈａｎ〇｜?ＭＥＰ｜Ｍｔｈｗ＊Ｙ??ＯｏＡ?Ａｉ〇ａ?ｉ－Ｓｗｅ?系?？？？？？？？？？？？？■？?｜“ｂｉ〇ｍａＭ?｜??１?ＳｖｉｎｅＣｙｃＩｔ?？°广＞??Ａｃ？ｔｏ＊ｃ？ｆｙｉ－ＣｏＡ?ｆ〇ｒｍ？ｔ？?—１?．??Ｕ?＾?ｌ?ＴＣＡ?Ｃｙｃｌｅ?＞＊Ｃ０，??ＭＭＧ＾ｏＡ?？？？？？ＴｉＪｌｕｗ?—一?Ｓｕｃｃ－￥＾ＣａＡ＾＼?＼??２ＮＡ０ＰＨ?－４?Ｍｅｖ？ｌｏｎ？ｅ？—ＨＭＣ＜ｏＡ?＼?ｒ???Ｈ?Ｍｔｖ＿ｗｙ?Ａｃ＾ａｐｅｏ＾＾ｊ＾ｃｏ．??ＶｐＨＢＣｙｃｌ＊／??图１．５甲羟戊酸生物合成途径（ａ）和本研究所使用的Ｍｅｘ／〇ｒ＠ｅｒａ?ＡＭＩ代谢网络中的甲羟戊酸生物??合成途径（ｂ）【７１】??Ｆｉｇｕｒｅ?１．５?Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ?（ａ）?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?ｔｈｅ??Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ?ＡＭ?１?ｍｅｔａｂｏｌｉｃ?ｎｅｔｗｏｒｋ?ｕｓｅｄ?ｉｎ?ｔｈｉｓ?ｓｔｕｄｙ?（ｂ）［７１］??本实验室的研究者朱文亮通过在通过ＭｅｘｒｏｒｇＭｅｍ１?ＡＭＩ菌株中构建了异源表达甲??羟戊酸的上游合成途径，利用基因过表达、基因筛选和ＲＢＳ工程方法优化酶的表达生??产甲羟戊酸
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本文编号：2859050