含硫香料对产肠毒素大肠杆菌毒力基因的表达及抑制机理的研究

发布时间：2020-11-02 08:07

　　 随着产肠毒素大肠杆菌引起的食物中毒数量的增加,以及耐药性细菌的大量出现,研发新型的、安全的防腐剂是国内外研究的热点问题。产肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素(st)和不耐热肠毒素(lt)是主要的致病因子。含硫化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗微生物的作用而被广泛关注。本文选取异硫氰酸苄酯(BITC)、二烯丙基二硫醚(DADS)和异硫氰酸苯乙酯(PEITC)三种外源化合物,探究其对产肠毒素大肠杆菌抑菌活性影响,通过RT-PCR方法,探究亚抑制浓度下异硫氰酸苄酯、二烯丙基二硫醚和异硫氰酸苯乙酯对毒力因子表达、信号分子AI-2相对活性以及群体感应基因表达的影响。为了探究异硫氰酸苄酯、二烯丙基二硫醚和异硫氰酸苯乙酯对产肠毒素大肠杆菌致病机理的影响,根据ATP试剂盒测定其对菌体细胞总ATP和胞外ATP的影响,通过扫描电镜观察对产肠毒素大肠杆菌菌体形态影响。结果表明:异硫氰酸苄酯、二烯丙基二硫醚和异硫氰酸苯乙酯最小抑菌浓度分别为160μmol/L,2mmol/L和400μmol/L。异硫氰酸苄酯、二烯丙基二硫醚和异硫氰酸苯乙酯均能下调毒力因子的表达,且呈一定的浓度依赖性。此外,异硫氰酸苄酯和二烯丙基二硫醚可以抑制产肠毒素大杆菌信号分子AI-2相对活性的表达,且呈一定的浓度依赖性。异硫氰酸苄酯和二烯丙基二硫醚可以下调群体感应基因LuxS和SdiA的表达。细胞总ATP含量降低,细胞外ATP的含量增加。通过扫描电镜观察异硫氰酸苄酯和异硫氰酸苯乙酯可以引起细胞表面皱缩,塌陷,甚至发生破裂,导致细胞内容物外泄。含硫化合物不仅能抑制产肠毒素大肠杆菌毒力基因,信号分子和群体感应基因表达,而且对菌体的形态学也会产生影响。说明含硫化合物具有作为新型的食品防腐剂抑制产肠毒素大肠杆菌的潜在应用价值。
【学位单位】：大连工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TS264.3
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 含硫化合物
        1.1.1 含硫化合物的发展趋势
        1.1.2 含硫化合物来源
        1.1.3 含硫化合物结构特点
        1.1.4 含硫化合物主要种类
            1.1.4.1 异硫氰酸苄酯（BITC）
            1.1.4.2 二烯丙基二硫醚（DADS）
            1.1.4.3 异硫氰酸苯乙酯（PEITC）
    1.2 产肠毒素大肠杆菌（ENTEROTOXIGENICESCHERICHIACOLIETEC）概述
        1.2.1 生物学特性
        1.2.2 致病机理
            1.2.2.1 不耐热肠毒素（heat-labileenterotoxin,LT）
            1.2.2.2 耐热肠毒素（Heat-stableenterotoxin,ST）
            1.2.2.3 定值因子
            1.2.2.4 鞭毛
        1.2.3 外源物质对致病性产肠毒素大肠杆菌的抑制作用
            1.2.3.1 海洋微生物溶菌酶
            1.2.3.2 乳酸链球菌素
            1.2.3.3 二氢杨梅素
            1.2.3.4 中草药
    1.3 群体感应概述
        1.3.1 LuxS/AI-2型感应系统
        1.3.2 SdiA
    1.4 研究的目的及意义
第二章 含硫化合物的抑菌活性研究
    2.1 实验材料与仪器
        2.1.1 实验菌株
        2.1.2 实验样品
        2.1.3 培养基
        2.1.4 试剂及药品
        2.1.5 仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 供试菌的活化
        2.2.2 样品处理
        2.2.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定
        2.2.4 生长曲线的测定
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 BITC对产肠毒素大肠杆菌最小抑制浓度测定结果
        2.3.2 PEITC对产肠毒素大肠杆菌最低抑制浓度测定结果
        2.3.3 DADS对产肠毒素大肠杆菌最小抑制浓度测定结果
        2.3.4 BITC对产肠毒素大肠杆菌生长的影响
        2.3.5 PEITC对产肠毒素大肠杆菌生长曲线的影响
        2.3.6 DADS对产肠毒素大肠杆菌生长的影响
        2.3.7 讨论
    2.4 本章小结
第三章 含硫化合物对菌体毒力基因表达的影响
    3.1 实验材料与仪器
        3.1.1 实验菌株
        3.1.2 实验样品
        3.1.3 培养基的配置
        3.1.4 实验试剂与药品
        3.1.5 仪器设备
    3.2 实验方法
        3.2.1 菌株活化
        3.2.2 样品制备
        3.2.3 细菌总RNA提取与检测
        3.2.4 除杂与cDNA合成
        3.2.5 实时荧光定量PCR
            3.2.5.1 引物特异性验证
            3.2.5.2 含硫化合物对ETEC的毒力基因（st、lt）表达的影响
        3.2.6 统计分析
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 RNA的提取与检测
        3.3.2 引物特异性检测
        3.3.3 含硫化合物对ETEC毒力基因表达的影响
            3.3.3.1 BITC对耐热毒素和不耐热毒素表达的影响
            3.3.3.2 DADS对耐热肠毒素和不耐热肠毒素表达的影响
            3.3.3.3 PEITC对耐热肠毒素和不耐热肠毒素表达的影响
        3.3.4 讨论
    3.4 本章小结
第四章 含硫化合物对菌体群体感应基因表达的影响
    4.1 实验材料与仪器
        4.1.1 实验菌株
        4.1.2 实验样品
        4.1.3 培养基的配置
        4.1.4 实验试剂与药品
        4.1.5 仪器设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 菌株活化
        4.2.2 样品制备
        4.2.3 含硫化合物对产肠毒素大肠杆菌群体感应信号分子的影响
        4.2.4 含硫化合物对产肠毒素大肠杆菌群体感应基因表达的影响
        4.2.5 统计分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 含硫化合物对产肠毒素大肠杆菌信号分子表达的影响
            4.3.1.1 BITC对信号分子AI-2相对活性表达的影响
            4.3.1.2 DADS对信号分子AI-2相对活性表达的影响
        4.3.2 含硫化合物对产肠毒素大肠杆菌群体感应基因的影响
            4.3.2.1 BITC对LuxS和SdiA表达的影响
            4.3.2.2 DADS对LuxS和SdiA表达的影响
        4.3.3 讨论
    4.4 本章小结
第五章 含硫化合物对菌体生物特性的影响
    5.1 实验材料与仪器
        5.1.1 实验菌株
        5.1.2 实验样品
        5.1.3 试剂与药品
    5.2 实验方法
        5.2.1 菌株活化
        5.2.2 样品处理
        5.2.3 总ATP和胞外ATP的测定
            5.2.3.1 总ATP的测定
            5.2.3.2 胞外ATP测定
        5.2.4 扫描电镜（SEM）
        5.2.5 统计分析
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 总ATP和胞外ATP测定
        5.3.2 含硫化合物对产肠毒素大肠杆菌菌体形态的影响
        5.3.3 讨论
    5.4 本章小结
第六章 结论与展望
    结论
    展望
参考文献
致谢

【参考文献】

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本文编号：2866793