乳清蛋白源ACE抑制肽的分离纯化与结构鉴定

发布时间：2020-11-02 22:18

　　 高血压是最常见的一种全球性的疾病。血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme,ACE)是血压升高的关键因素。它可以将血管紧张素I(十肽)水解为血管紧张素II(八肽)。血管紧张素II能够结合血管平滑肌和内皮细胞上的AT1受体,导致血管收缩。它还使内皮依赖性血管舒张缓激肽酶失活,从而导致高血压。ACE抑制肽是一类从食物中提取的具有降高血压活性的多肽,通过抑制ACE的活性进而抑制血压的升高。本文主要研究了胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶水解乳清蛋白制备ACE抑制肽的方法,确定了胃蛋白酶和胰蛋白酶水解乳清蛋白的最佳工艺条件。将水解物以3kD超滤膜过滤,并用Sephadex G-15进一步纯化。利用纳升级反相液相色谱-串联质谱(nano RPLC-MS/MS)对纯化后样品(组分B1)进行多肽结构鉴定。研究结果如下:(1)研究并优化了以乳清蛋白为原料,胃蛋白酶水解乳清蛋白制备ACE抑制肽的工艺。通过单因素试验及正交试验证明,当水解温度37℃、酶与底物比1:100、底物浓度6%时,胃蛋白酶水解乳清蛋白制备所得的ACE抑制肽对ACE的抑制率最高,ACE抑制率为86%。再将胃蛋白酶最佳水解条件下得到的产物进行胰蛋白酶水解,当水解温度55℃、底物浓度6%、酶和底物比值1:500时,胰蛋白酶水解乳清蛋白制备所得的ACE抑制肽对ACE的抑制率最高,ACE抑制率为72%。最终,胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶水解物的IC50值为425.66μg/mL。(2)研究了乳清蛋白的酶解物的分离纯化工艺。采用超滤技术对乳清蛋白进行分离,得到三个组分,A1(10 kD)、A2(3~10 kD)和A3(3 kD)。三种组分中,A3的ACE抑制率最高,为92%,其IC50值为327.28μg/mL。组分A3通过Sephadex G-15(葡聚糖凝胶过滤层析色谱)分离得到2个组分,B1和B2。组分B1的ACE抑制率为97.5%,显著高于B2组分的ACE抑制率83%(P0.05),B1的IC50值为273.82μg/mL。(3)采用纳升级反相液相色谱-串联质谱(nano RPLC-MS/MS)对纯化后的乳清蛋白酶解物B1组分进行结构鉴定,得到73条多肽序列。根据ACE抑制肽普遍为短肽,选7条多肽序列(VLVLDTDY、LSPNPTQLE、DLEILLQK、DEALEKFD、LDAQSAPLR、MAASDISL、LIVTQTMK)。用固相合成的方法合成以上7条多肽。经检测,只有LIVTQTMK有ACE抑制活性,其IC50值为248.1μg/mL。(4)采用分子对接技术研究了ACE抑制肽LIVTQTMK与ACE酶的相互作用。结果表明,静电力和疏水作用是LIVTQTMK与ACE结合的主要驱动因素。其中,LIVTQTMK的Leu1和Lys8的质子化N原子分别与ACE的Asp77和Asp237的羧基形成盐桥作用,Met7的羧基和Gln5的骨架氧原子分别与Arg124和Arg415的胍基形成盐桥作用;Gln5与Tyr231和Trp235,Thr6与Thr131以及Met7与Asn417形成强弱不同的氢键(氢键长度为2.8~3.5?)
【学位单位】：天津商业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ464.7;O657.63
【部分图文】：

A 代表反应体系中加入 ACE 抑制剂时的吸光度；BCE 与 HHL 反应时的吸光度，即对照；C 代表空白反应的吸光指 ACE 催化的酶反应被抑制一半时，抑制剂的浓度。IC50 值配制成不同质量浓度梯度的溶液，并测定各个溶液的 ACE 抑的 ACE 抑制率输入到 Graph Pad Prism5 统计软件中进行计算处理xcel 2007、Origin 8.5、Graph Pad Prism5、SPSS 对数据进行处 SPSS 20.0 软件分析试验结果。与讨论力法 2.3.2 绘制酪氨酸标准曲线，结果见图 2-1。由标准曲线可知计算得到胃蛋白酶活力为 260U/mg，胰蛋白酶活力为 261U/

蛋白酶解液的 ACE 抑制率为 80.35%，A1 组分的 ACE 抑制率为CE抑制率为84%，A3组分的ACE抑制率为92%，显著高于其他组分择A3 组分进行下一步分离纯化。经计算，A3组分的 IC50 值为327.2表 3-3 酶解物不同组分的 ACE 抑制活性Table 3-3 ACE inhibitory activity of different components of enzymatic hydrol组分 ACE 抑制率（%）粗酶解物 80.35A1 68A2 84A3 96phadex G-15 凝胶过滤层析色谱分离乳清蛋白酶解物

图 5-1 LIVTQTMK 分子动力学模拟 RMSD 图Fig. 5-1 The RMSD image of molecular dynamics simulation of LIVTQTMK合位点预测分子动力学模拟最后一帧构象进行结合模式分析。ACE 蛋白的结合旋（α-Helix）和 β-折叠（β-sheet）狭长的两端开口的管状结构。TQTMK 呈直线型结合在 ACE 的口袋，C 端氨基酸残基暴露在袋LIVTQTMK 与 ACE 口袋内的氨基酸残基形成多种类型的相互作用MK 的 Leu1 和 Lys8 的质子化 N 原子分别与 ACE 的 Asp77 和 Asp2作用，Met7 的羧基和 Gln5 的骨架氧原子分别与 Arg124 和 Arg415用；Gln5 与 Tyr231 和 Trp235，Thr6 与 Thr131 以及 Met7 与 Asn4氢键（氢键长度为 2.8~3.5 ）。这些极性作用为 LIVTQTMK 的结电力贡献。Leu1、Ile2 和 Gln5 支链上的非极性结构部位与周围8、Trp369、Leu149 和 Trp235）形成疏水作用，为其结合提供了广
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 罗鹏;周金玲;何东平;潘思轶;;葵花籽ACE抑制肽的体内降压活性初步研究[J];粮食与油脂;2019年02期

2 何荣海;马海乐;余筱洁;;条斑紫菜ACEI抑制肽的超滤分离与离子交换纯化![J];农业机械学报;2012年02期

3 段秀;张玉锋;庄永亮;;食源性血管紧张素转化酶抑制肽研究进展[J];食品工业科技;2012年20期

4 管骁;彭剑秋;金周筠;沈宇;;食源性血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展[J];食品与发酵工业;2011年07期

5 于一丁;于志鹏;赵文竹;刘静波;;血管紧张素转化酶抑制肽稳定性研究[J];食品工业科技;2010年01期

6 鲁军;任迪峰;王建中;TANOKURA Masaru;;螺旋藻源血管紧张素转化酶抑制肽的纯化和鉴定[J];生物化学与生物物理进展;2010年05期

7 李勇湧;黄文祥;朱卫民;李崇智;张德梅;;β-内酰胺酶抑制肽的活性研究[J];中国抗生素杂志;2010年04期

8 夏树华;王璋;;反相高效液相色谱/基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分离鉴定螺蛳血管紧张素转换酶抑制肽[J];色谱;2007年01期

9 安桂香;庄桂东;徐振凯;姚明经;迟玉森;;食物中血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展[J];食品研究与开发;2006年06期

10 徐榕榕,陶冠军,李进伟,杨严俊;高效液相色谱测定血管紧张素转换酶抑制肽的活性[J];河南工业大学学报(自然科学版);2005年04期

相关博士学位论文 前10条

1 Naveed Hussain;糖巨肽蛋白源DPP-4抑制肽的制备、鉴定及抑制机理研究[D];中国农业科学院;2019年

2 罗鹏;葵花籽ACE抑制肽的分离纯化、结构分析与稳态化研究[D];华中农业大学;2018年

3 周红丽;南瓜籽蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的研究[D];湖南农业大学;2012年

4 黎观红;食物蛋白源血管紧张素转化酶抑制肽的研究[D];江南大学;2005年

5 李云;乳源酵母发酵牛乳产血管紧张素转换酶抑制肽的研究[D];浙江大学;2015年

6 郑亚军;油棕粕谷蛋白-2血管紧张素转化酶抑制肽制备与降血压活性研究[D];陕西师范大学;2016年

7 舒国伟;羊乳源ACE抑制肽制备、分离纯化及鉴定[D];陕西科技大学;2016年

8 赵元晖;海地瓜蛋白水解物中ACE抑制肽的分离纯化及合成[D];中国海洋大学;2009年

9 翟爱华;高活性米糠蛋白ACE抑制肽的制备及降血压效果研究[D];沈阳农业大学;2015年

10 张艳萍;贻贝蛋白中ACE抑制肽的制备及其构效关系研究[D];浙江工商大学;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 谢雪琼;鲢鱼肌肉脯氨酰内肽酶及抑制肽的研究[D];集美大学;2019年

2 马莹;乳清蛋白源ACE抑制肽的分离纯化与结构鉴定[D];天津商业大学;2019年

3 孙姗姗;罗非鱼鱼皮胶原制备及其ACE抑制肽释放规律的研究[D];厦门大学;2018年

4 柯丽娟;鲍鱼内脏胶原ACE抑制肽的分离纯化及其理化性质的研究[D];福建农林大学;2015年

5 吴迪;醋蛋中ACE抑制肽的酶法制备、分离纯化及其活性保护[D];安徽农业大学;2017年

6 邹基豪;绿豆ACE抑制肽的纯化及功能特性研究[D];吉林农业大学;2018年

7 李晶晶;扇贝裙边ACE抑制肽的分离纯化及活性研究[D];大连海洋大学;2018年

8 颜泽;牡蛎（Ostrea tailienwhanensis）ACE抑制肽的制备技术的研究[D];大连海洋大学;2018年

9 尹方平;碱法和挤压协同酶法制备高粱蛋白及ACE抑制肽的研究[D];南京财经大学;2017年

10 邹琳;鲣鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽的酶解制备及功能活性评价[D];浙江大学;2019年

本文编号：2867649