毕赤酵母和枯草杆菌产碱性蛋白酶的对比研究

发布时间：2020-11-04 02:51

　　 碱性蛋白酶是一类具备高催化性能、环境友好的生物催化剂,其可快速有效地将蛋白类物质分解成多肽和氨基酸,被广泛的应用于洗涤产品、皮革加工和食品加工等行业。在碱性蛋白酶的发酵过程中,可利用异源表达宿主对碱性蛋白酶进行过量表达。微生物发酵碱性蛋白酶的过程,周期短、产量高、营养物质廉价易得,适于工业化大规模培养。在碱性蛋白酶的发酵生产和应用研究中,大多数人只针对一种产碱性蛋白酶菌株,缺乏对不同菌株重组表达宿主的构建、发酵条件、超滤纯化和洗涤性能差异的了解。文章对比研究了真菌毕赤酵母和细菌枯草杆菌在重组表达宿主构建、发酵条件、超滤纯化和洗涤性能方面的差异,并进行了对比分析。第一,成功构建了新的碱性蛋白酶异源表达宿主毕赤酵母(pPICZα-AP)和枯草杆菌(pBE2R-AP),并且两种菌株都成功的表达了碱性蛋白酶。随后对两种菌株进行目标产物的发酵,发现相对于毕赤酵母,枯草杆菌表达宿主获得的碱性蛋白酶活力更高。第二,对比研究了毕赤酵母和枯草杆菌产碱性蛋白酶的最优培养条件。研究对比发现,相对于枯草杆菌,毕赤酵母获得最佳酶活力需要更长的发酵时间。在营养物的利用种类方面,毕赤酵母更倾向于利用甲醇、甘油和YPD;枯草杆菌则偏向于利用葡萄糖和酵母提取物,对甲醇和甘油几乎没有利用。在营养物的利用比例方面,毕赤酵母对碳源的单次需求量低于枯草杆菌,但是在碳源总添加量方面却高于枯草杆菌。在培养过程的物理因素方面,两种菌株的最佳产酶pH相差不大;但在培养温度方面,较低的温度更有利于毕赤酵母的产物表达,并且毕赤酵母在发酵过程对氧量的需求相对较大。第三,超滤作用对毕赤酵母和枯草杆菌发酵液进行了有效的浓缩,并提高了发酵液中碱性蛋白酶的活力。相对于枯草杆菌,毕赤酵母发酵液超滤过程的膜通量更低,超滤时间更长,其原因可能是毕赤酵母发酵液中溶质粒径较大所导致的。在毕赤酵母和枯草杆菌发酵液的超滤过程中,溶质的粒径和Zeta电位是动态变化的。粒径与Zeta电位绝对值的变化趋势相同,均随超滤时间的延长而增大,其原因与发酵液中溶质的聚集有关。最后,对比了在相同总酶活力下超滤前后不同菌株来源碱性蛋白酶的洗涤性能,两种菌株发酵液超滤后的碱性蛋白酶洗涤效果会略有下降。发酵液的洗涤效果排序为:添加毕赤酵母发酵液的洗涤剂添加枯草杆菌发酵液的洗涤剂未添加碱性蛋白酶的洗涤剂;对比了在不同总酶活力下,毕赤酵母、枯草杆菌和市售碱性蛋白酶的洗涤性能,其洗涤效果排序均为:添加毕赤酵母碱性蛋白酶的洗涤剂市售碱性蛋白酶≈添加枯草杆菌碱性蛋白酶的洗涤剂,并且洗涤效果随酶活力的升高而增加。由洗涤前后国标蛋白污布JB02的ART-FTIR光谱图可知,毕赤酵母和枯草杆菌来源的碱性蛋白酶,在洗涤过程中均可有效的破坏蛋白污渍的肽键以及蛋白质的二级结构,使蛋白质污渍分解并从国标蛋白污布JB02脱落下来。因此,加酶洗涤剂获得了更好的去污效果。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ925.2
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 文献综述及选题背景
    引言
    1.1 碱性蛋白酶的性质和催化原理
        1.1.1 碱性蛋白酶的基本性质
        1.1.2 碱性蛋白酶底物特异性
        1.1.3 碱性蛋白酶活性
        1.1.4 碱性蛋白酶稳定性
        1.1.5 碱性蛋白酶的催化原理
    1.2 微生物产碱性蛋白酶
        1.2.1 碱性蛋白酶的微生物来源
        1.2.2 细菌和真菌的细胞结构
        1.2.3 细菌和真菌来源的碱性蛋白酶
        1.2.4 碱性蛋白酶异源表达
        1.2.5 碱性蛋白酶的微生物发酵
    1.3 碱性蛋白酶的超滤分离
        1.3.1 超滤技术原理
        1.3.2 影响生物酶超滤性能的因素
        1.3.3 提高碱性蛋白酶超滤性能的措施
    1.4 碱性蛋白酶在洗涤剂中的应用
        1.4.1 碱性蛋白酶作为洗涤添加剂
        1.4.2 现代碱性蛋白酶洗涤剂的挑战
        1.4.3 提高碱性蛋白酶的洗涤性能
    1.5 选题思路和研究内容
        1.5.1 选题思路
        1.5.2 研究内容
    1.6 本课题的创新之处
第二章 毕赤酵母和枯草杆菌工程菌株构建的对比研究
    2.1 引言
    2.2 实验材料和实验仪器
        2.2.1 实验所用仪器
        2.2.2 实验所用试剂
        2.2.3 实验所用菌株和质粒
        2.2.4 实验所用培养基
        2.2.5 实验所用溶液
    2.3 实验过程
        2.3.1 毕赤酵母和枯草杆菌感受态细胞的制备
        2.3.2 重组表达宿主的转化
        2.3.3 阳性克隆的鉴定
        2.3.4 碱性蛋白酶重组菌株的筛选和表达
        2.3.5 SDS-PAGE验证
        2.3.6 碱性蛋白酶酶活力的测定
    2.4 实验结果和讨论
        2.4.1 碱性蛋白酶产物酪氨酸标准曲线
        2.4.2 重组表达宿主的结果鉴定
        2.4.3 碱性蛋白酶的表达及结果分析
    2.5 本章小结
第三章 毕赤酵母和枯草杆菌最优发酵条件的对比研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料和实验仪器
        3.2.1 实验仪器
        3.2.2 实验试剂
    3.3 试验方法
        3.3.1 测定不同菌株产碱性蛋白酶的最优培养天数
        3.3.2 测定不同菌株产碱性蛋白酶的最优碳源
        3.3.3 测定不同菌株产碱性蛋白酶的最优氮源
        3.3.4 测定不同菌株产碱性蛋白酶的最优pH
        3.3.5 测定不同菌株产碱性蛋白酶的最优温度
        3.3.6 测定不同菌株产碱性蛋白酶的最优装液量
    3.4 实验结果和讨论
        3.4.1 重组菌株的产酶曲线
        3.4.2 碳源对菌株产酶效果的影响
        3.4.3 氮源对菌株产酶效果的影响
        3.4.4 pH对菌株产酶效果的影响
        3.4.5 温度对菌株产酶效果的影响
        3.4.6 装液量对菌株产酶效果的影响
    3.5 本章小结
第四章 毕赤酵母和枯草杆菌超滤性能的对比研究
    4.1 引言
    4.2 实验材料和实验仪器
        4.2.1 实验所用仪器
        4.2.2 实验所用试剂
    4.3 试验方法
        4.3.1 碱性蛋白酶发酵液的制备
        4.3.2 不同菌株碱性蛋白酶发酵液的超滤
        4.3.3 碱性蛋白酶活力的测定
        4.3.4 动态光散射测定碱性蛋白酶粒径和电位的变化
    4.4 实验结果和讨论
        4.4.1 不同菌株发酵液超滤过程膜通量的变化
        4.4.2 不同菌株发酵液超滤过程中酶活力的变化
        4.4.3 不同菌株发酵液超滤过程中粒径的变化
        4.4.4 不同菌株发酵液超滤过程中Zeta电位的变化
    4.5 本章小结
第五章 毕赤酵母和枯草杆菌碱性蛋白酶洗涤性能的对比研究
    5.1 引言
    5.2 实验材料和实验仪器
        5.2.1 实验所用仪器
        5.2.2 实验所用试剂
    5.3 试验方法
        5.3.1 洗涤性能测试
        5.3.2 白度测试
        5.3.3 污布的红外光谱测试
    5.4 实验结果与讨论
        5.4.1 超滤前后不同菌株发酵液洗涤性能的对比
        5.4.2 不同碱性蛋白酶洗涤性能的对比
        5.4.3 蛋白污布在不同碱性蛋白酶洗涤前后的ART-FTIR
    5.5 本章小结
第六章 实验总结和展望
    6.1 实验总结
    6.2 实验展望
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简况及联系方式

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本文编号：2869503