L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达、改造及全细胞制备β-丙氨酸

发布时间：2020-11-10 07:36

　　 β-丙氨酸是一种天然的β型氨基酸,是重要的医药前提物质,在保健食品及化工产品中有重要的应用。与化学法合成β-丙氨酸相比,生物转化法具有清洁环保、转化率高、条件温和、副产物少等优势。但用于合成β-丙氨酸的L-天冬氨酸α-脱羧酶(ADC)酶活性普遍偏低,且存在严重的机理性反应失活现象,使酶的利用率较低,因此筛选更高活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶,以及弱化酶的机理性反应失活现象和改善酶学性质,使酶具有更有优良的催化特性,利于高效制备β-丙氨酸。本论文异源高效表达了ADC酶,实施定点突变,提高酶活力,弱化ADC蛋白的机理性失活,实现了高效催化β-丙氨酸。(1)将来源于枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和植物乳杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因(L-aspartateα-decarboxylase,PanD)分别连接到pET-28a载体上,于大肠杆菌中表达。在16℃、180 r·min~(-1)条件下诱导12 h。经SDS-PAGE验证,观察到大小不同的两条条带,且诱导表达后粗酶液可以转化Asp产生β-丙氨酸,说明三种来源的ADC蛋白都成功表达,且能自我剪切成熟。利用E.coli BL21/pET28a-BsPanD菌株进行初步的全细胞转化验证实验,确认ADC蛋白可以转化Asp生成β-丙氨酸。(2)利用亲和层析的方法,对三种来源的ADC蛋白进行纯化,纯化后的蛋白纯度在90%以上。测定BsADC、CgADC和LpADC的最适温度分别为65、70和70℃,BsADC、CgADC和LpADC三种蛋白的最适pH分别为7.0、6.5和6.5。在三种酶中,BsADC在酶活和稳定性均较好,因而选择该酶进行后续研究。(3)对BsADC活性中心附近的Tyr58、Ile60、Glu56、Asn41和Lys63五个位点进行定点突变。保守位点Tyr58位的7种突变和Ile60位的饱和突变会影响BsADC酶的剪切成熟,使BsADC失活或活性降低;Asn41Gly、Glu56Ser和Lys63Glu三个突变点不影响酶的剪切成熟,且37℃条件下,酶活相对于原始酶,提高了1.3-1.6倍。E56S的温度稳定性也略有提升,而N41G和K63E稳定性不变;在减缓机理性反应失活现象上,经过两个小时的反应E56S的残余酶活是原始酶的1.4倍,而N41G和K63E没有明显改善或弱化ADC酶的机理性反应失活现象。(4)将E56S基因分别构建在pET-28a、pMA-5和pXMJ-19三种载体上,然后转化到大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌三种宿主细胞中。然后采用5 L的发酵罐进行诱导培养,收集的菌体在37℃、pH 7.0和600 r·min~(-1)条件下,进行全细胞转化。经过9 h的转化,E.coli BL21/pET28a-E56S转化获得215.3 g·L~(-1)的β-丙氨酸,摩尔转化率高达94%。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TQ922
【部分图文】：

图 1-1 细菌和真核生物中的 β-丙氨酸合成途径[14]Fig. 1-1 mechanisms of β-alanine biosynthesis in bacteria and eukaryotesL-天冬氨酸 α-脱羧酶直接催化 Asp 合成 β-丙氨酸；（2）尿嘧啶通过三个酶的作用降解丙氨酸；（c）精胺通过三个酶的氧化作用生成 β-丙氨酸。法合成 β-丙氨酸，主要分为酶转化法和发酵代谢法两种。其中酶法主要以

EcADC蛋白的催化机理[24]

3-1 天冬氨酸 α-脱羧酶基因的 PCR 扩Fig. 3-1 PCR amplification of PanD genrker；1：BsPanD 基因；2：CgPanD 基回收、酶切、酶连，将三种基因分18-T-CgPanD、pMT18-T-LpPanD
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 孙涛;孙斐;巢骏;谢晶;周冬香;;C_(70)-β-丙氨酸衍生物抗氧化性的研究[J];化学研究与应用;2012年05期

2 孙涛;孙斐;谢晶;周冬香;;C_(60)/C_(70)-β-丙氨酸衍生物抗氧化性的研究[J];化学试剂;2012年07期

3 熊焕贵;陈肇熙;;家兔延髓孤束核区微电泳β-丙氨酸抑制呼吸单位放电[J];生理学报;1987年03期

4 曾向潮,徐石海,施文兵,邓芹英;N-(3-吲哚甲酰基)-β-丙氨酸甲酯的合成和表征[J];精细化工;2004年06期

5 黎冬冬;徐兴烟;柳翔;曾向潮;唐桂红;;N-(2-吡咯甲酰基)-β-丙氨酸甲酯的烷基化反应[J];化学试剂;2010年06期

6 孙涛;孙斐;巢骏;谢晶;周冬香;;不同加成数C_(60)-β-丙氨酸衍生物的还原能力及金属螯合能力[J];东北农业大学学报;2012年08期

7 胡芳;柳翔;曾向潮;黄岗;;N-(1-烷基-3-吲哚甲酰基)-β-丙氨酸乙酯的合成[J];化学试剂;2012年08期

8 李永胜,刘文广,姚康德,王国昌,李贺先;氯化亚铁/β-丙氨酸席夫碱配合物催化甲基丙烯酸甲酯原子转移自由基聚合的研究[J];高分子学报;2004年05期

9 冯其明;;β-丙氨酸摄入干预对下坡跑运动诱发的肌肉损伤的影响[J];基因组学与应用生物学;2018年10期

10 叶碧璇;曹建民;黄聪;曹卉;;β-丙氨酸对运动大鼠肌肉糖代谢的影响[J];运动;2018年16期

相关硕士学位论文 前10条

1 张腾辉;L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达、改造及全细胞制备β-丙氨酸[D];江南大学;2018年

2 胡孟;L-组氨酸和β-丙氨酸对肉仔鸡生产性能、肉品质及肌源活性肽的影响[D];中国农业科学院;2018年

3 高宇;一釜双酶法转化富马酸制备β-丙氨酸催化体系的构建及工艺优化[D];江南大学;2017年

4 梁姗姗;代谢工程改造大肠杆菌合成β-丙氨酸[D];江南大学;2017年

5 齐博;β-丙氨酸对肉仔鸡生产性能、肌肉品质和肌源活性肽的影响[D];中国农业科学院;2017年

6 黄聪;β-丙氨酸补充对运动大鼠骨骼肌肌肽含量及抗氧化能力的影响[D];北京体育大学;2015年

7 楼坚;生物转化法生产β-丙氨酸的研究[D];浙江工业大学;2006年

8 王晓燕;β-丙氨酸对甜菜夜蛾生长发育及体内酶活性的影响[D];华中农业大学;2010年

9 马军;补喂β-丙氨酸对伊犁马血浆氨基酸和肌肽含量及运动水平的影响[D];新疆农业大学;2016年

10 黄秀敏;酶法合成β-丙氨酸工艺及其机理研究[D];浙江工业大学;2009年

本文编号：2877667