利用分子改造技术提高S-腺苷甲硫氨酸合成酶的催化性能

发布时间：2020-11-12 00:23

　　 S-腺苷甲硫氨酸(SAM),即S-腺苷-L-甲硫氨酸,是一种重要的生理活性物质。通过转甲基、转硫基、转氨丙基等作用,SAM参与了生物体内40多种生化反应。临床研究表明,SAM对肝脏疾病、抑郁症和关节炎等均具有较好的治疗效果。随着对SAM临床研究的深入,SAM对其他疾病的药理作用也不断被证实,包括阿尔兹海默症、偏头痛、肿瘤等。目前,工业上主要是利用酵母菌发酵生产SAM。但该方法存在生产周期长、底物转化率低、提取过程复杂等问题。相比较而言,酶催化法具有反应时间短、提取过程较简单等优势。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MAT)是生物体内唯一一种用于SAM合成的酶。它催化ATP和L-甲硫氨酸反应生成SAM,同时生成副产物正磷酸(Pi)和焦磷酸(PPi)。为了选取一种合适的MAT用于SAM的生产,本研究根据国内外对MATs的报道以及实验室常用的菌株,选取了 8种用于合成MAT的基因,用质粒pET-28a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达。通过比较诱导表达后重组菌的菌体密度和酶的性质,发现重组大肠杆菌MAT基因的菌株诱导表达后菌体密度较高、蛋白表达量较高、比酶活较高,因此对其进行进一步研究。考虑到大肠杆菌来源的MAT(eMAT)比酶活仅为1.82 U/mg,且当反应体系中SAM浓度超过1 mM,eMAT相对酶活不超过20%,这将不利于SAM的合成,因此对其催化活性进行分子改造。首先,根据检测Pi的分光光度法成功构建了适用于本研究的高通量筛选方法,并通过优化易错PCR体系中Mn2+浓度成功构建了以eMAT为亲本的有效突变体文库。经过不断的初筛和复筛,获得一个有效突变体R74H,比酶活从野生型eMAT的1.82 U/mg增加至4.15 U/mg。与此同时,根据文献中有关MATs酶活的报道,以野生型eMAT为亲本,基于同源序列对比结果进行定点突变,获得突变体I303V和I65V,比酶活分别为2.76 U/mg和4.57 U/mg。为了考察突变体用于SAM生产的可行性,测定不同底物浓度下SAM积累量。结果表明,10 mM底物浓度下,野生型eMAT SAM积累量仅为1.62 mM,突变体R74H、I65V、I303V SAM积累量分别为1.48 mM、1.84 mM和2.40 mM。比较SAM对底物的抑制常数发现,突变体I303VKi,ATP为0.20 mM、Ki,L-met为0.23 mM,而突变体R74HKi,ATP为0.05 mM、Ki,L-met为0.20 mM。说明在该酶反应体系中,产物抑制是影响SAM合成的主要因素。因此,以产物抑制较轻的突变体I303V为亲本进行分子改造,以期减轻eMAT的产物抑制。考虑到突变体I65V产物抑制较野生型eMAT减轻,首先通过定点突变将303位和65位进行组合。eMAT严重的产物抑制可能是由于SAM阻止了 ATP与酶的结合。而ATP位于活性中心,因此对活性中心附近非保守性位点进行半理性设计。结果表明,突变体I303V/I65V/L186V不仅在10 mM底物浓度下的SAM积累量从突变体I303V的2.44 mM增加至3.27 mM,比酶活也提高1.54倍。虽然突变体I303V/I65V/N104A比酶活提高1.3倍,但10 mM底物浓度下的SAM积累量不超过2 mM,因此对104位进行定点饱和突变。通过高通量筛选,获得的突变体 I65V/I303V/L186V/N104K 比酶活从突变体 I65V/I303V/L186V 的 3.78 U/mg增加至6.02 U/mg,但在10 mM底物浓度下的SAM积累量下降至2.68 mM。另外,突变体I65V/I303V/L186V/N104K最适反应温度为55℃,最适反应pH为8.0,37℃热处理8 h后酶活仍有80%的残余;而野生型eMAT最适反应温度为60℃,最适反应pH为8.4,37℃热处理8 h后酶活仅残余30%。总体而言,本研究通过分子改造获得的突变体I65V/I303V/L186V/N104K的催化性能较野生型eMAT和已报道MATs均有明显提高。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TQ426.97;TQ463
【部分图文】：

１．２?ＳＡＭ的理化性质??１．２．１?ＳＡＭ的结构分析??ＳＡＭ结构式于１９５２年被Ｃａｎｔｏｎｉ所阐明ｍ。由图１．１可看出，ＳＡＭ分子中??不仅含一个永久带正电荷的极性较强的锍基（ｐＫａ＝１２．５），还含有三个可解离的??基团，分别为：与嘌呤环相连的氨基（ｐＫａ＝３．４）、Ｌ－甲硫氨酸残基的氨基（ｐＫａ＝７．８）??和Ｌ－甲硫氨酸残基的铵基（ｐＫａ＝１．８）。强极性的锍基使得与其相连的碳被活化，??因此易受亲核试剂的攻击而发生裂解反应；三个可解离基团解离常数的差异，使??得ＳＡＭ的水解受ｐＨ影响较大。??１．２．２?ＳＡＭ的稳定性??ＳＡＭ的稳定性较差，在室温中性或碱性ｐＨ条件下，很容易失活。除１．２．１??结构分析中所提到的因锍基而引起的裂解失活和ｐＨ等因素引起的水解失活两种??失活机制外，ＳＡＭ还会因自发发生消旋反应而失去活性［９—１（）１。??为提高ＳＡＭ的稳定性，工业上一般都是以ＳＡＭ盐的形式在低温避光干燥??的环境中保存ＳＡＭ。在ＳＡＭ成盐时

比于化学合成法和微生物发酵法，酶催化法因具有立体选择性高、反应反应时间短、产物易分离、对环境友好等特点，成为近年来研究ＳＡ点方向。ＭＡＴ虽然广泛存在动物、植物和微生物，但天然表达的ＭＡＴ分离纯化困难，因而限制了酶催化法的大规模使用。因此，构建高效的工程菌成为用酶催化法制备ＳＡＭ的首要任务。目前，有关ＭＡＴ的中在动物肝脏、酿酒酵母以及大肠杆菌三种来源的ＭＡＴ上。??

的测定??Ｐｉｅｒｃｅ１?Ｍ?ＢＣＡ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?Ａｓｓａｙ?Ｋｉｔ微孔板法进行测定，说明书进行，具体步骤如下：??００?ｍＭ?Ｔｒｉｓ－ＨＣ丨将ＢＳＡ标准液按说明书稀释Ａ－Ｆ?６ＣＡ?Ｒｅａｇｅｎｔ?Ａ?与?ＢＣＡ?Ｒｅａｇｅｎｔ?Ｂ?以?５０：１?（ｖ／ｖ）充ｎｔ?（ＷＲ）备用；??孔板中加入２５?（ｉＬ样品或标准液稀释液，每个样品个孔中继续加入２００?ｐＬＷＲ，振荡混匀；??孔板加盖后置于３７?°Ｃ培养箱中，保温３０?ｍｉｎ；??孔板冷却后，用酶标仪于５６２?ｎｍ处测量吸光值；??蛋白浓度标准曲线，并计算样品蛋白的浓度。蛋白。??
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本文编号：2879964