重组类弹性蛋白多肽水凝胶的制备

发布时间：2020-11-12 05:24

　　 研究背景:水凝胶是一类具有三维网络结构的聚合物,能在水中显著溶胀但不溶解。形成水凝胶的原料包括天然材料和合成材料两大类。天然材料具有良好的生物相容性,但存在来源有限、产量低及不同批次材料间有性质差异的限制。而合成材料虽然组成和性质可控,但往往官能团单一且生物相容性较差。通过基因工程和蛋白质工程得到的重组蛋白质兼具了天然材料的生物相容性和合成材料的可控性。类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELPs)是一类由弹性蛋白特征性功能单元串联重复构成的蛋白分子,通常通过基因工程方法制备。ELP与弹性蛋白类似,不仅具有良好的力学性能、生物相容性和生物可降解性,而且具备特殊的反向热凝胶性质,因而在近些年受到广泛关注。研究目的:设计一种ELP,建立其在大肠杆菌中的高效表达方法;以该ELP为原料,使用物理交联、化学交联和酶交联方式制备水凝胶。研究方法:(1)利用重叠延伸PCR(overlap extension PCR,OE-PCR)扩增ELP核心序列,通过递归定向连接(recursive directional ligation,RDL)核心序列至一定重复,利用基因工程的方法构建ELP原核表达载体pET28a-[ELP_α]_5-[ELP_β]_(12)-[ELP_α]_5。(2)使用大肠杆菌ER2566原核表达菌株,自诱导表达目的蛋白[ELP_α]_5-[ELP_β]_(12)-[ELP_α]_5。利用ELP的温度响应型可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)特性进行目的蛋白的纯化,并对纯化后的目的蛋白进行定量。(3)分别用物理交联、化学交联和酶交联的方式,探索不同浓度ELP的成胶情况。研究结果:(1)双酶切及测序结果显示:成功构建pET28a-[ELP_α]_5-[ELP_β]_(12)-[ELP_α]_5原核表达载体。(2)可溶性分析表明:目的蛋白以可溶形式表达。经纯化后,目的蛋白的纯度和得率分别达到92.6%和80.46%。定量结果显示:1L诱导液可分离得到1.05g目的蛋白。(3)成胶结果显示:ELP浓度为3%时,成胶温度为40°C;ELP浓度为12.5%和15%时,成胶温度为37°C。稳定性实验显示:在物理交联实验中,3%的样品在第21天时凝胶网络完全降解;12.5%和15%的样品在第28天时凝胶网络完全降解。尽管随着ELP浓度增加,凝胶的稳定性有所改善,但物理交联的水凝胶整体稳定性依然较差;在化学交联实验中,3%的样品在第21天时剩余凝胶质量为18.67%,第28天时凝胶网络仍未完全降解;12.5%和15%的样品在第28天时剩余凝胶质量分别为82%和91.33%。化学交联形成水凝胶的稳定性较物理交联大大提高;在酶交联实验中,3%的样品在第21天时剩余凝胶质量为7.67%,第28天时凝胶网络基本降解;12.5%和15%的样品在第28天时剩余凝胶质量分别为61.67%和76.33%。酶交联形成水凝胶的稳定性介于物理交联和化学交联之间。研究结论:成功设计并合成了一种类弹性蛋白多肽,并用不同的交联方式制备了以此多肽为基底的蛋白类水凝胶。
【学位单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;TQ427.26
【部分图文】：

图 1.1 人弹性蛋白原的 cDNA 结构[8]。Figuer 1.1 cDNA structure of human tropoelastin.在细胞外基质中，弹性蛋白原自组装形成弹性蛋白，随后与微原纤维共同组装产生弹性纤维。该过程涉及弹性蛋白原之间的交联。为了促进交联作用的发生，弹性蛋白原必须进行排列，这种排列是通过凝聚作用产生的。该凝聚过程利用了弹性蛋白原的可逆相变特性。在低温下，弹性蛋白原溶于水溶液；随着温度升高，弹性蛋白原分子通过疏水结构域之间的相互作用变得有序进而发生聚集。这种现象完全可逆并通过热力学控制，该过程也被称为低临界溶解温度( low critical solution temperature, LCST )行为，受到蛋白质浓度、盐浓度和 pH 值的影响。自组装后，弹性蛋白原分子通过亲水区域的赖氨酸残基进行酶交联，最终形成含锁链素和异锁链素交联结构的弹性蛋白[9]。链间交联和大量疏水残基直接导致弹性蛋白不溶于水。1.1.2 弹性蛋白的性质由于不溶于水，对弹性蛋白性质的研究在很长一段时间内受到了阻滞。然而，可溶

图 1.2 递归定向连接示意图Figure 1.2 Schematics of recursive directional ligation利用基因工程合成 ELP 的优点包括：首先，从生物表达系统中很容易获得产量相对较高的目的蛋白，且不需要色谱法，通过温度响应性可逆相变循环可以方便地对其进行纯化[13]。其次，利用该法合成 ELP 可以精确控制多肽的序列组成、分子量，从而控制其立体结构[11, 14]，而这些变量在化学合成过程中往往难以控制[15]。再者，转化至宿主细胞的重组质粒可以长期保存，因此构建好的重组质粒可以永久使用。最后，如果目的蛋白具有高级结构，则宿主体内的折叠机制可以帮助形成正确的二级或三级结构。1.2.2 类弹性蛋白多肽的性质为了研究 ELP 聚合物的特性，Urry 和同事们根据弹性蛋白疏水结构域中的多肽序列合成了一系列相关的寡聚体。他们首先观察到 ELP 聚合物以类似于弹性蛋白原的方式发生凝聚。对其进行深入研究发现：ELP 具有热响应性，并经历可逆温度转变( Inversetemperature transition, ITT )[16]。当温度低于转变温度( Transition temperature, Tt )时，ELP

图 1.3 ELP 的可逆温度相变Figure 1.3 The inverse temperature transition of ELPELP 的 Tt 值可以通过分光光度计测量蛋白溶液的浊度来确定。该值由缓冲液组成、盐浓度、聚合物浓度、多肽链长度、任意功能侧链和客座氨基酸残基的电离程度以及分子的极性排列等因素共同决定[18-21]。ELP 温度依赖性可逆相转变通常发生在 2-3°C 范围内。经美国相关监管机构[22]批准，序列为(Gly-Val-Gly-Val-Pro)n的聚合物已被应用于许多组织和血液测试。对该聚合物的体内外研究均表明其具有良好的生物相容性。这可能与 ELP 的组成和天然弹性蛋白的化学组成类似有关。此外，ELP 可生物降解，降解产物为天然氨基酸。由于免疫系统通常难以区别天然的弹性蛋白和类弹性蛋白多肽，因此ELP 还具有低免疫原性。1.2.3 类弹性蛋白多肽的应用类弹性蛋白多肽(ELP)同时具有高度的生物相容性、生物可降解性、低免疫原性和
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本文编号：2880306