不同结构原花青素的制备及对食品中丙烯酰胺生成的影响

发布时间：2020-11-13 07:15

　　 美拉德反应在赋予热加工食品诱人的色泽与风味的同时,还会伴生出丙烯酰胺、5-羟甲基糠醛(HMF)等有害物质。其中丙烯酰胺具有显著的神经毒性和致癌性,且在薯片、饼干等淀粉类食品中含量较高,受到了人们的极大关注。原花青素是黄酮类化合物的一种,具有广泛的抗氧化、抗癌、抗炎等生物活性,且在自然界中含量丰富,生物安全性高。近年来,多酚对食品加工过程中危害物的控制开始受到重视。但是,关于原花青素对食品中丙烯酰胺和HMF生成的影响尚缺乏系统和深入的研究。本论文从多种植物中分离和制备不同结构的原花青素,鉴定其结构,测定其对丙烯酰胺和HMF生成的抑制作用的构效关系,并探讨干预机制,为原花青素资源开发利用提供基础,为控制食品加工中危害物生成及机理研究提供新方法和新思路。首先,制备不同结构的原花青素。将高粱麸皮提取物在Sephadex LH-20凝胶柱上用30%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇和70%丙酮依次洗脱,其中100%甲醇和70%丙酮洗脱组分分别作为高聚体-1和高聚体-2。以高粱高聚原花青素为原料,分别添加表儿茶素(EC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)为亲核试剂,在酸性条件下降解后液液萃取,制备得到寡聚体-1和寡聚体-2。采用超声辅助溶剂浸提和柱层析结合的方法纯化蔓越莓原花青素,酸性条件下降解后液液萃取,得到寡聚体-3。从市售葡萄籽原花青素提取物中分液提取,得到寡聚体-4。同时,详细研究了高聚体降解制备寡聚体的过程。动力学研究显示,反应初期符合表观一级动力学模型,在反应后期则速率减缓且表现出较为复杂的动力学形态。升温可显著提升反应速率,且温度对高聚体降解的影响符合阿伦尼乌斯公式,活化能计算为83.0 kJ/mol。降低pH可促进降解反应进行。当EC浓度较低时,添加EC可以加速反应;而当EC充足时,更多的EC并不能改变高聚体的降解速率。建立了中心组合实验设计模型,决定系数R~2达0.98,优化所得最佳条件为:74℃、pH 1.24、61 min、质量比0.89,预测得率87.0±4.0%。验证实验得率86.0±1.2%,与预测结果吻合。然后,采用正相高效液相色谱串联质谱法(NP-HPLC MS/MS)、基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)和半胱胺硫解法鉴定了各个原花青素组分的结构。结果如下:寡聚体-1、高聚体-1和高聚体-2是由B型连接的儿茶素(CAT)和EC所组成,平均聚合度分别为1.6、6.9和12.2;寡聚体-2的组成单元为CAT、EC和EGCG(占62%);寡聚体-3由CAT和EC组成,含有53.9%的A型连接键;寡聚体-4的结构单元为CAT、EC和(E)CG(占10.7%);寡聚体-2、3、4的平均聚合度分别为1.7、1.6、1.6。半胱胺可以作为亲核试剂用于原花青素的硫解分析,硫解产物以0.1%三氟乙酸(TFA)和乙腈为流动相可以在反相高效液相色谱(RP-HPLC)上良好分离,并根据保留时间和质谱图等鉴定了原花青素单体、A型二聚体和相应的半胱胺加合物,包括(表)儿茶素-半胱胺加合物、A型二聚体-半胱胺加合物和(表)儿茶素没食子酸酯-半胱胺加合物。接着,研究了原花青素对天冬酰胺+葡萄糖模型体系和油炸薯片体系中丙烯酰胺和HMF生成的影响,发现均表现出抑制作用。在天冬酰胺+葡萄糖模型中,抑制活性在50-200μg/mL范围内随浓度增高而上升。单体对丙烯酰胺的抑制率从约30%上升至约70%,对HMF的抑制率则是从约60%上升至约90%。原花青素对油炸薯片中丙烯酰胺和HMF的生成的抑制作用,在0.01-0.1 mg/mL范围内随着浓度的升高而增强,在0.1-1 mg/mL范围内则随浓度升高而减弱。在最佳抑制浓度下,对丙烯酰胺的抑制率为40%左右,对HMF的抑制率为50%左右。原花青素结构对抑制活性的影响(等质量浓度下比较):B型连接的原花青素对丙烯酰胺和对HMF的抑制活性均强于A型连接的原花青素。聚合度增高,对HMF的抑制活性显著降低,对丙烯酰胺的抑制活性没有显著变化。不同结构单元的原花青素对于丙烯酰胺的抑制率相似,对于HMF来说,含有没食子酰结构的原花青素,抑制率较低。进一步,以EC为代表,研究了原花青素对丙烯酰胺和HMF生成的干预机制。发现EC的添加使得天冬酰胺+葡萄糖模型中丙烯酰胺和HMF的生成量下降,而3-脱氧葡萄糖醛酮(3-DG)的生成量上升。在天冬酰胺+HMF模型中,添加EC可以抑制比天冬酰胺+葡萄糖模型中更多的丙烯酰胺,HMF的残存量也显著降低(p0.05)。研究发现,EC与HMF在180℃条件下共热会生成聚合物,此路径消耗美拉德反应羰基中间体HMF,是EC抑制丙烯酰胺生成的分子机制。鉴定出了由一个HMF桥连两个CAT/EC单元所组成的二聚加合物,以及由两个HMF桥连三个CAT/EC单元所组成的三聚加合物。发现了反应体系的褐变主要是由于EC与HMF的聚合,而非EC的自身氧化或聚合等。最后,发现了EC具有促进3-氨基丙酰胺(3-APA)裂解生成丙烯酰胺的作用。提出了一条新的干预路径:EC通过与3-APA加合,生成更容易裂解产生丙烯酰胺的Schiff碱类化合物,从而促进3-APA向丙烯酰胺的转化。鉴定出了该路径中5种3-APA与EC的加合物。精确分子量测定值与理论计算值相比偏差均小于1.4 mDa,二级质谱与推测的结构相吻合,五种加合物含量随时间的变化规律也与提出的路径相吻合。综合来看,EC可以通过消耗HMF从而抑制丙烯酰胺的生成,也可以通过促进3-APA的裂解从而促进丙烯酰胺的生成。因此,EC对于美拉德反应中丙烯酰胺的干预作用是这两条路径的综合结果,最终表现出的是抑制效果。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.2;TQ28
【部分图文】：

1.1 原花青素1.1.1 原花青素的结构、分布以及生物活性1.1.1.1 原花青素的结构原花青素是黄烷-3-醇单体聚合而成的化合物，因其在酸性溶液中加热可产生花青素而得名，又叫做缩合单宁。黄烷-3-醇是一类重要的黄酮类化合物，它具有黄酮类化合物C6-C3-C6 的母核结构，含有两个芳环(环 A、环 B)和一个杂环(环 C)。在杂环的 C2-C3位饱和，C3 位带有一羟基，因此被称为黄烷-3-醇。黄烷-3-醇单体的结构如图 1-1 所示，根据 B 环羟基数目、C3 位羟基是否没食子酰化和手性碳原子构象的不同，有不同结构。其中 B 环有一个、两个或三个羟基的分别叫做阿福豆素(AFZ)、儿茶素(CAT)、没食子儿茶素(GC，又叫棓儿茶素)。黄烷-3-醇单体中有两个手性碳原子，C2 位绝大多数是 R 构象，C3 位则是 R 和 S 构象并存，C3 位羟基与 B 环顺式的冠以“表”字，分别为表阿福豆素(EAF)、表儿茶素(EC)和表没食子儿茶素(EGC)。若 C3 位羟基被没食子酰化，则形成儿茶素没食子酸酯(CG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)[1]。

图 1-2 B 型(图中 A)和 A 型(图中 B)原花青素的结构Fig. 1-2 Structures of B-type (A) and A-type (B) procyanidins花青素的分布青素广泛存在于多种植物中，是继木质素之后，含量第二大的天然多原花青素含量的报道多以常见食品为研究对象。DePascual-Teresa 等[3]蔬菜和饮料等中的原花青素含量，发现水果中原花青素含量约为 0-5菜中则是 0-154mg/100g 鲜重，茶和酒类中均含有原花青素。EC 是其次是 CAT 和原花青素 B2。Gu 等[2]分析了 88 种水果、蔬菜、谷类和9 种含有原花青素，其中 21 种仅含 CAT/EC 结构单元且为 B 型连接，花青素在其他食品中也是主要成分。在草莓、覆盆子、斑豆和杏仁等豆素组分，葡萄、黑加仑和榛子等中则含有 GC/EGC 的结构，葡萄、心果等还含有 CG/ECG 的结构，蔓越莓、花生、李子、肉桂中则含有素组分。水果尤其是浆果中富含原花青素，含量最高的要数葡萄籽， 干基[4]。谷物中含有原花青素的主要有高粱、大麦和荞麦[5,6]，其中 s皮中原花青素可达 3965mg/100g 鲜重。多种豆类、坚果、酒类和巧克

图 1-3 食品中丙烯酰胺的形成路径[63]Fig. 1-3 Pathways for the formation of acrylamide in foods.2.3.2 优化热加工过程的参数和方法美拉德反应程度与热量输入息息相关，选择较低的加工温度、避免过长的加热时间能减少丙烯酰胺产量。与普通油炸相比，采用低温真空油炸，可显著减少薯片中丙胺含量[69]。Palazoglu 等[70]发现，采用程序控温的方法，在油炸过程的后期降低油温有效降低薯条成品中丙烯酰胺的含量。.2.3.3 添加抑制剂1)天冬酰胺酶天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，通过降低天冬酰胺这一前体物质的含量，从而抑烯酰胺的生成。据报道，使用 10500U/L 的天冬酰胺酶水溶液浸泡处理，可使薯条烯酰胺减少 60-85%，薯片中丙烯酰胺减少 60%[71]。2) pH 调整计食品体系较低的 pH 可抑制丙烯酰胺的生成，这可能是因为低 pH 可促进天冬酰胺-氨基的质子化，进而阻止其与羰基化合物的亲核加成[72]。Jung 等[72]的研究表明，油
【参考文献】

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本文编号：2881905