Thermobaculum terrenum海藻糖合酶的耐热和催化机制分析及其催化活性定点改造的研究

发布时间：2020-12-22 06:21

　　海藻糖是生物体内的一种非常重要的双糖,它由两个葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键连接而成,在生物体中起着许多重要作用。海藻糖除了作为碳源和能源外,还可以保护机体免受低温、脱水、高渗、乙醇毒性和氧化等极端条件的影响。本论文以海藻糖合酶生产菌Thermobaculum terrenum为研究基础,对其酶学性质、蛋白质结构与耐热机制的关系、海藻糖合酶催化机制以及催化活性定点改造几个方面进行了研究。研究的内容包括以下几个方面:（1）海藻糖合酶酶学性质的测定和耐热机制分析:Thermobaculum terrenum海藻糖合酶（TtTS）的最适反应温度为45℃;最适反应pH值为7.5;1mM的SDS,EDTA,Cu²⁺和Ni²⁺抑制海藻糖合酶的活性,将浓度提高到10mM的情况下效果更加明显,而Ba²⁺,K⁺,Mg²⁺,Zn²⁺,Fe²⁺,Ca²⁺和Mn²⁺能够提高其活性。在150mM麦芽糖作为底物的... 

【文章来源】：齐鲁工业大学山东省

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

海藻糖结构式Fig1.1Themolecularstructureoftrehalose

1.2.2 海藻糖合酶的结构分析与催化机制的介绍Zhang 等人在2011年通过对耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）的海藻糖合酶（MsTS）研究证明了一个双取代反应机制（如图1.2），这与其他GH13家族成员是一致的[51]。海藻糖合酶的催化中心是由Asp-Glu-Asp构成的三联体，催化过程分为两个阶段：第一步是一个质子由酸碱催化的Glu转移到分子间糖苷键的氧原子上，同时α-1,4-糖苷键被亲核催化的Asp攻击而切断，形成葡萄糖和葡萄糖基，然后酶的构象发生转变，形成α-1,1糖苷键的海藻糖。糖苷键断裂后水分子进入活性中心作为亲核试剂攻击葡萄糖基时，就会使得麦芽糖分子水解成为两个葡萄糖分子，形成反应的副产物。对DrTS的结构分析证实了subdomain B和S7之间的闭合构象，降低了水分子进入的可能性

结果如图2.1所示。M 1 2图2.1TtTS PCR电泳图Fig 2.1 TtTS PCR electrophoresis注:M泳道为DNAmaker，1、2泳道为TtTS基因。由图2.1可知，该电泳条带所在位置在1000bp-2000bp之间，TtTS基因全长为1644bp，实验与实际相符，说明海藻糖合酶基因被成功扩增。（2） pET-28a质粒的双酶切将从大肠杆菌DH5α里提出的质粒通过快切酶EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切线性化，为下一步连接做准备。电泳结果如图2.2所示，pET-28a质粒全长5369bp，电泳条带位置位于5000bp稍大一点

【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：2931294