基于代谢工程提高大肠杆菌L—苏氨酸产量的研究
发布时间：2020-12-30 19:10
L-苏氨酸作为人体必需八种氨基酸之一,被广泛运用于食品、药品和饲料等领域。随着市场需求的日益扩大,开发一株高产L-苏氨酸的菌株变得十分必要。大肠杆菌（Escherichia coli）由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸产生菌基因改造的模式菌。本文以实验室保藏的苏氨酸生产菌株E.coli THR为出发菌株,通过代谢工程手段改造出苏氨酸高产菌E.coli THR8。随后对摇瓶发酵培养基、发酵条件、5 L发酵罐转速及补料进行优化,进一步提高了L-苏氨酸产量。主要研究结果如下:（1）增加通往L-苏氨酸合成的碳通量,同时抑制苏氨酸的胞内吸收,减少过量苏氨酸对关键酶的反馈抑制。利用FLP/FRT重组酶系统敲除天冬氨酸激酶III（lysC）、磷酸果糖激酶II（pfkB）和苏氨酸主要吸收蛋白（sstT）,分别构建E.coli THRΔlysC（即E.coli THR1）、E.coli THRΔlysCΔpfkB（即E.coli THR2）和E.coli THRΔlysCΔpfkBΔsstT（即E.coli THR3）。L-苏氨酸产量较出发菌株分别提高0.55%、5.04%和9.97%,糖酸...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
L-苏氨酸分子结构式Fig.1-1ThemolecularstructureofL-threonine
德国的 DegussaAG（现为 Evonik）和美国的 ADM 公司。国内梅花集团、阜丰集团、伊品生物、成福集团等公司也开展 L-苏氨酸生产[9,10]。然而我国 L-苏氨酸生产开始于上世纪 90 年代，经过 20 多年的快速发展，在产 L-苏氨酸菌株的知识产权、发酵产酸率、糖酸转化率、生产成本以及发酵废液的环保处理等方面尚具有较大的提升空间。1.2.2 L-苏氨酸生产方法目前，L-苏氨酸的生产方法包括：蛋白质水解、化学合成和微生物发酵[11]。其中，从生产成本、产酸得率、能源与环保等方面综合考虑，利用微生物发酵生产苏氨酸已成为目前的主流方法[12]。（1）蛋白质水解法L-苏氨酸主要存在于血粉，牛角和玉米麸质等天然蛋白质中。通过水洗、粉碎、加强酸水解蛋白质，再浓缩得到浓缩液，用活性炭脱色、上离交柱，洗脱收集苏氨酸部分[11]，具体流程如图 1-2。然而，由于这些蛋白质中苏氨酸含量低，且制备过程复杂，因此必须处理大量洗脱液。此外，与 L-苏氨酸共同存在的其他氨基酸随废液丢弃，既不经济也不环保。后来，蛋白质水解法逐渐被淘汰。
第一章 绪论K I、II 和 III，存在不同的遗传决定和调控机制。AK I（三种酶中丰度编码。thrA 的表达被 L-苏氨酸和 L-异亮氨酸以共价方式阻遏，AK I反馈抑制。AK II 含量最少，由 metL 基因编码。metL 的表达被 L-蛋氨I的活性不受天冬氨酸家族中任何氨基酸的抑制。AK III是 lysC基因编码达被 L-赖氨酸阻遏，AK III 的活性被 L-赖氨酸抑制。AK I 和 II 作为双化结构域，一个用于 AK 活性，另一个用于高丝氨酸脱氢酶（HSD）也被称为 AK I-HSD I 和 AK II-HSD II[33]。不同于 E. coli，C. glutamlysC 编码），受到 L-赖氨酸和 L-苏氨酸的协同反馈抑制[34]。研究表明 C1076A，造成第 311 位苏氨酸→异亮氨酸、第 359 位甘氨酸→天冬解除赖氨酸对天冬氨酸激酶反馈抑制的同时也解除了赖氨酸和苏氨酸制[35,36]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶G359D突变解除赖氨酸与苏氨酸协同抑制的研究[J]. 徐德雨,郑小梅,赵晶,郑平,赵树欣. 生物技术通报. 2017(11)
[2]微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展[J]. 董迅衍,王小元. 食品与生物技术学报. 2016(12)
[3]大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响[J]. 杨冬美,李华,李由然,张梁,丁重阳,李赢,顾正华,石贵阳. 微生物学通报. 2017(01)
[4]增强乙醛酸循环对大肠杆菌合成L-苏氨酸的影响[J]. 周茜,郑会明,刘辉,谢希贤,徐庆阳,张成林,陈宁. 现代食品科技. 2015(10)
[5]大肠杆菌氧化还原辅因子代谢工程[J]. 王白云,王晓玥,王智文,陈涛,赵学明. 化学进展. 2014(09)
[6]大肠杆菌转运蛋白SstT和RhtC的改造对L-苏氨酸产量的影响[J]. 梁媛,杨书尧,刘宏亮,郝小明,林海龙,谢希贤,陈宁. 现代食品科技. 2014(04)
[7]不同温度、时间、IPTG和菌种浓度对丁肝抗原蛋白表达量的影响[J]. 丁军颖,伊瑶,卢学新,苏秋东,田瑞光,邱丰,毕胜利. 医学研究杂志. 2012(05)
[8]天冬氨酸家族主要氨基酸高产菌株的选育策略[J]. 吴瑶瑶,裘娟萍. 氨基酸和生物资源. 2012(01)
[9]L-苏氨酸高产菌株的选育及发酵条件优化研究[J]. 周旭波. 现代食品科技. 2011(08)
[10]谷氨酸棒杆菌metX、dapA基因敲除对苏氨酸合成的影响[J]. 吕扬勇,伍展红,郑穗平. 生物技术通报. 2011(01)
博士论文
[1]基于代谢工程选育谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸高产菌[D]. 徐建中.江南大学 2014
[2]L-苯丙氨酸生产菌株的构建、代谢调控和发酵条件优化[D]. 周海岩.江南大学 2011
硕士论文
[1]强化葡萄糖代谢途径提高L-赖氨酸发酵水平的研究[D]. 刘冬冬.江南大学 2017
[2]耐酸和耐热苏氨酸菌株构建[D]. 郑会明.天津科技大学 2016
[3]L-苏氨酸生产菌的构建及发酵优化[D]. 周茜.天津科技大学 2016
[4]糖酵解途径和转运系统的改造对大肠杆菌发酵L-苏氨酸的影响[D]. 梁媛.天津科技大学 2014
[5]基因重组大肠杆菌发酵生产苏氨酸条件优化[D]. 郝静祖.济南大学 2012
[6]L-苏氨酸高产菌的选育[D]. 解晓鹏.甘肃农业大学 2009
本文编号：2948153
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
L-苏氨酸分子结构式Fig.1-1ThemolecularstructureofL-threonine
德国的 DegussaAG（现为 Evonik）和美国的 ADM 公司。国内梅花集团、阜丰集团、伊品生物、成福集团等公司也开展 L-苏氨酸生产[9,10]。然而我国 L-苏氨酸生产开始于上世纪 90 年代，经过 20 多年的快速发展，在产 L-苏氨酸菌株的知识产权、发酵产酸率、糖酸转化率、生产成本以及发酵废液的环保处理等方面尚具有较大的提升空间。1.2.2 L-苏氨酸生产方法目前，L-苏氨酸的生产方法包括：蛋白质水解、化学合成和微生物发酵[11]。其中，从生产成本、产酸得率、能源与环保等方面综合考虑，利用微生物发酵生产苏氨酸已成为目前的主流方法[12]。（1）蛋白质水解法L-苏氨酸主要存在于血粉，牛角和玉米麸质等天然蛋白质中。通过水洗、粉碎、加强酸水解蛋白质，再浓缩得到浓缩液，用活性炭脱色、上离交柱，洗脱收集苏氨酸部分[11]，具体流程如图 1-2。然而，由于这些蛋白质中苏氨酸含量低，且制备过程复杂，因此必须处理大量洗脱液。此外，与 L-苏氨酸共同存在的其他氨基酸随废液丢弃，既不经济也不环保。后来，蛋白质水解法逐渐被淘汰。
第一章 绪论K I、II 和 III，存在不同的遗传决定和调控机制。AK I（三种酶中丰度编码。thrA 的表达被 L-苏氨酸和 L-异亮氨酸以共价方式阻遏，AK I反馈抑制。AK II 含量最少，由 metL 基因编码。metL 的表达被 L-蛋氨I的活性不受天冬氨酸家族中任何氨基酸的抑制。AK III是 lysC基因编码达被 L-赖氨酸阻遏，AK III 的活性被 L-赖氨酸抑制。AK I 和 II 作为双化结构域，一个用于 AK 活性，另一个用于高丝氨酸脱氢酶（HSD）也被称为 AK I-HSD I 和 AK II-HSD II[33]。不同于 E. coli，C. glutamlysC 编码），受到 L-赖氨酸和 L-苏氨酸的协同反馈抑制[34]。研究表明 C1076A，造成第 311 位苏氨酸→异亮氨酸、第 359 位甘氨酸→天冬解除赖氨酸对天冬氨酸激酶反馈抑制的同时也解除了赖氨酸和苏氨酸制[35,36]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶G359D突变解除赖氨酸与苏氨酸协同抑制的研究[J]. 徐德雨,郑小梅,赵晶,郑平,赵树欣. 生物技术通报. 2017(11)
[2]微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展[J]. 董迅衍,王小元. 食品与生物技术学报. 2016(12)
[3]大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响[J]. 杨冬美,李华,李由然,张梁,丁重阳,李赢,顾正华,石贵阳. 微生物学通报. 2017(01)
[4]增强乙醛酸循环对大肠杆菌合成L-苏氨酸的影响[J]. 周茜,郑会明,刘辉,谢希贤,徐庆阳,张成林,陈宁. 现代食品科技. 2015(10)
[5]大肠杆菌氧化还原辅因子代谢工程[J]. 王白云,王晓玥,王智文,陈涛,赵学明. 化学进展. 2014(09)
[6]大肠杆菌转运蛋白SstT和RhtC的改造对L-苏氨酸产量的影响[J]. 梁媛,杨书尧,刘宏亮,郝小明,林海龙,谢希贤,陈宁. 现代食品科技. 2014(04)
[7]不同温度、时间、IPTG和菌种浓度对丁肝抗原蛋白表达量的影响[J]. 丁军颖,伊瑶,卢学新,苏秋东,田瑞光,邱丰,毕胜利. 医学研究杂志. 2012(05)
[8]天冬氨酸家族主要氨基酸高产菌株的选育策略[J]. 吴瑶瑶,裘娟萍. 氨基酸和生物资源. 2012(01)
[9]L-苏氨酸高产菌株的选育及发酵条件优化研究[J]. 周旭波. 现代食品科技. 2011(08)
[10]谷氨酸棒杆菌metX、dapA基因敲除对苏氨酸合成的影响[J]. 吕扬勇,伍展红,郑穗平. 生物技术通报. 2011(01)
博士论文
[1]基于代谢工程选育谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸高产菌[D]. 徐建中.江南大学 2014
[2]L-苯丙氨酸生产菌株的构建、代谢调控和发酵条件优化[D]. 周海岩.江南大学 2011
硕士论文
[1]强化葡萄糖代谢途径提高L-赖氨酸发酵水平的研究[D]. 刘冬冬.江南大学 2017
[2]耐酸和耐热苏氨酸菌株构建[D]. 郑会明.天津科技大学 2016
[3]L-苏氨酸生产菌的构建及发酵优化[D]. 周茜.天津科技大学 2016
[4]糖酵解途径和转运系统的改造对大肠杆菌发酵L-苏氨酸的影响[D]. 梁媛.天津科技大学 2014
[5]基因重组大肠杆菌发酵生产苏氨酸条件优化[D]. 郝静祖.济南大学 2012
[6]L-苏氨酸高产菌的选育[D]. 解晓鹏.甘肃农业大学 2009
本文编号：2948153
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