基于八臂PEG聚集和阿拉伯半乳聚糖-PEG修饰的长效葡激酶及其药学性质研究

发布时间：2021-01-19 07:52

　　葡激酶（SAK）由于具有良好的溶解纤维蛋白的活性,可用于冠状动脉血栓和急性心肌梗塞的治疗。然而,SAK在体内的循环半衰期很短,需要重复给药才能维持其生理作用,这将给患者带来极大的痛苦;此外,SAK具有较强的免疫原性、稳定性较差,这些都限制了SAK的临床应用。聚乙二醇（PEG）修饰和多糖（PS）修饰可以延长SAK的循环半衰期,并降低其免疫原性,但同时会降低SAK的生物活性。为了解决以上问题,本论文选择去掉N-末端前10位氨基酸残基,且C-末端引入Gly-Gly-Cys的重组SAK作为研究对象,以降低野生型SAK的免疫原性,且能实现远离SAK活性区域的定点修饰。本论文设计采用8-arm PEG定点修饰SAK,探索使SAK多聚化的修饰方法对SAK药代动力学和生物活性等性质的影响。另外,采用低分子量的PEG为连接桥,介导阿拉伯半乳聚糖（AG）修饰SAK,探索该修饰方法对SAK免疫原性、药代动力学和生物活性等性质的影响。采用8-arm PEG-MAL 10 kDa定点修饰SAK的C-末端巯基,并用两种不同的线性PEG修饰剂mPEG-MAL 10 kDa和MAL-PEG-MAL 10 kDa定点修... 

【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所)北京市

【文章页数】：154 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

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【参考文献】：
期刊论文
[1]重组蛋白药物研发及专利分析[J]. 陆娇,陈大明,江洪波.  生物产业技术. 2015(01)
[2]SPF级Balb/c小鼠脏器质量、脏器系数、血常规、血生化指标的测定与比较[J]. 张修彦,詹纯列,肖育华,唐咸国.  中国组织工程研究与临床康复. 2011(41)
[3]Arg77和Glu80定点突变同时去除葡激酶中的T和B细胞抗原表位（英文）[J]. 徐瑞光,贺进田,贾锴,陈希,刘建伟,朱科.  微生物学报. 2011(05)
[4]蛋白质药物的功能分类及发展趋势[J]. 朱迅.  中国医药生物技术. 2010(01)
[5]重组蛋白药物的研究进展[J]. 任立华,刘忠,赵丽丽,夏续伟.  齐鲁药事. 2008(11)
[6]10种常见SPF级实验大、小鼠血液学及生化指标正常参考值的探讨[J]. 胡建武,卢胜明,车路平,贺争鸣,王洪,刘双环,马丽颖,孙岩松,江其辉,时彦胜,荣瑞章.  实验动物科学. 2007(02)
[7]RGD-葡激酶突变体（K130T,K135R）的制备与活性分析[J]. 宁保安,马茹,郑玉玲,高志贤,申博,姜永强.  生物工程学报. 2005(03)
[8]三种小鼠血液生理生化正常值的测定[J]. 王冬平,李善如,张敏,李升团,郑亚萍,耿志贤,李润芳.  实验动物科学与管理. 2000(02)



本文编号：2986625