不同补料工艺对蓝灰色链霉菌代谢及尼莫克汀合成影响研究

发布时间：2021-02-15 08:34

　　尼莫克汀是由蓝灰色链霉菌发酵生产的一种大环内酯类化合物,属于米尔贝霉素族抗生素。尼莫克汀通常被用作农用抗生素莫西克汀的合成前体,因其广谱的抗害虫特性,以及安全、高效,对人体无毒,对环境无害,不易产生抗药性等一系列特点,莫西克汀被誉为21世纪最具前景的绿色生物农药。但是现如今在尼莫克汀生物合成的调节与控制方面鲜有研究,这对进一步提高尼莫克汀产量以达到产业化要求造成了巨大的障碍。为了解决这些问题,本文利用高通量方法建立并优化了适合于尼莫克汀发酵的全合成培养基,并初步探索了不同补料工艺条件下蓝灰色链霉菌的代谢情况以及尼莫克汀合成调控机理。首先,本文建立了菌体高通量培养体系和产物高通量检测体系,通过单因素、Plackett-Burmandesign以及响应面实验对全合成培养基进行优化,使得最终的尼莫克汀的产量能够达到150.33 mg/L。之后通过摇瓶玻璃珠实验以及装液量实验研究尼莫克汀发酵过程剪切和溶氧的影响,最终在5 L发酵罐中通过改变搅拌转速以及桨型组合达到发酵体系高溶氧、低剪切,使得尼莫克汀最终产量达到191.59 mg/L。通过补糖补氨策略优化研究进一步提高了尼莫克汀的生物合成量。实... 

【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：92 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 生物农药概述
    1.2 尼莫克汀概述
        1.2.1 尼莫克汀理化性质
        1.2.2 尼莫克汀的生物合成及其研究现状
    1.3 高通量筛选全合成培养基
        1.3.1 高通量技术概述
        1.3.2 全合成培养基概述
        1.3.3 高通量筛选全合成培养基
    1.4 发酵过程优化
        1.4.1 溶氧与剪切优化
        1.4.2 基于在线参数的补料策略优化
    1.5 代谢物组学研究
    1.6 课题研究的背景、意义和内容
        1.6.1 课题研究的背景和意义
        1.6.2 研究内容
第2章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌种
        2.1.2 实验仪器
        2.1.3 常用试剂
        2.1.4 培养基配方
    2.2 培养方法
        2.2.1 斜面培养
        2.2.2 一级种子培养
        2.2.3 二级种子培养
        2.2.4 孔板发酵培养
        2.2.5 摇瓶发酵培养
        2.2.6 5L发酵罐发酵培养
    2.3 分析与测定方法
        2.3.1 pH测定
        2.3.2 菌体干重测定
        2.3.3 葡萄糖试剂盒测定葡萄糖含量
            2.3.3.1 葡萄糖标准曲线的制作
            2.3.3.2 发酵液中葡糖糖浓度测定
        2.3.4 铵离子浓度测定
            2.3.4.1 实验主要测试试剂
            2.3.4.2 铵离子标准曲线制作
            2.3.4.3 发酵液中铵离子浓度测定
        2.3.5 OUR和CER测定
        2.3.6 尼莫克汀含量测定
        2.3.7 菌体形态分析
第3章 尼莫克汀发酵全合成培养基的建立与优化
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 单因素优化发酵培养基
            3.2.1.1 碳源作用
            3.2.1.2 氮源作用
            3.2.1.3 磷源作用
        3.2.2 显著因子的确定
        3.2.3 最佳培养基配方确定
        3.2.4 5L发酵罐验证
        3.2.5 高通量检测平台建立
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 孔板装液量确定
        3.3.2 高通量检测平台建立
        3.3.3 葡萄糖浓度对尼莫克汀发酵的影响
        3.3.4 麦芽糖浓度对尼莫克汀发酵的影响
        3.3.5 氮源对尼莫克汀发酵的影响
        3.3.6 磷酸氢二钾对尼莫克汀发酵影响
        3.3.7 显著因素的确定
        3.3.8 最佳培养基配方确定
        3.3.9 5L发酵罐验证
    3.4 本章小结
第4章 基于在线参数调控的尼莫克汀发酵过程优化
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 菌种和培养基
            4.2.1.1 菌种
            4.2.1.2 斜面培养基以及种子培养基
            4.2.1.3 5L发酵培养基
        4.2.2 培养方法
            4.2.2.1 5L发酵罐发酵培养
            4.2.2.2 葡萄糖和硫酸铵的补料策略
        4.2.3 分析与测定方法
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 摇瓶装液量和玻璃珠数量对蓝灰色链霉菌发酵生产尼莫克汀的影响
        4.3.2 5L发酵罐中转速和供氧水平对尼莫克汀生物合成的影响
        4.3.3 在不同补糖策略下尼莫克汀发酵情况
        4.3.4 在不同补铵策略下尼莫克汀发酵情况
    4.4 本章小结
第5章 不同补铵策略对蓝灰色链霉菌发酵合成尼莫克汀影响机制的探索
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 快速取样装置
        5.2.2 提取方法
        5.2.3 样品衍生
        5.2.4 精确分析检测方法建立
            5.2.4.1 GC-MS检测方法
            5.2.4.2 LC-MS/MS检测方法
13C同位素标记品的制作">        5.2.5 ¹³C同位素标记品的制作
        5.2.6 数据处理及分析
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 各类代谢物的最适提取方法
        5.3.2 5L发酵罐中在不同补铵策略下菌体生长以及尼莫克汀合成情况
        5.3.3 与尼莫克汀生物合成相关的关键代谢物和代谢途径
        5.3.4 中心碳代谢途径与尼莫克汀生物合成的关系
        5.3.5 氨基酸代谢尼莫克汀生物合成的关系
        5.3.6 辅酶A类物质与尼莫克汀生物合成的关系
    5.4 本章小结
第6章 全文结论与展望
    6.1 全文总结
    6.2 展望
参考文献
致谢
攻读硕士期间撰写的论文及专利
附录Ⅰ


【参考文献】：
期刊论文
[1]利用基因工程定向阻断尼莫克汀工业生产菌株中多个杂质组份的生物合成[J]. 党福军,夏海洋,覃重军.  中国抗生素杂志. 2014(08)
[2]农用抗寄生虫抗生素尼莫克汀发酵工艺的初步研究[J]. 张珊瑚,阮奇城,卞雯,董梦雯,刘雅洁.  中国农学通报. 2014(21)
[3]生物农药研究进展与未来展望[J]. 邱德文.  植物保护. 2013(05)
[4]Optimization of a synthetic medium for ethanol production by xylose-fermenting Zymomonas mobilis using response surface methodology[J]. DONG HuiNa 1,2,4,5,ZHAO XueMing 2,4,5,MA YuanYuan 1* & ZHANG MinHua 1,3 1 Tianjin University R&D Center for Petrochemical Technology,Tianjin University,Tianjin 300072,China;2 Department of Biochemical Engineering,School of Chemical Engineering and Technology,Tianjin University,Tianjin 300072,China;3 State Key Laboratory of Engines,Tianjin University,Tianjin 300072,China;4 Key Laboratory of Systems Bioengineering,Ministry of Education,Tianjin University,Tianjin 300072,China;5 Edinburgh-Tianjin Joint Research Centre for Systems Biology and Synthetic Biology,Tianjin University,Tianjin 300072,China.  Chinese Science Bulletin. 2012(Z2)
[5]搅拌桨叶型式对庆大霉素产生菌菌丝形态及其生物合成的影响[J]. 郭瑞文,储炬,庄英萍,张嗣良.  中国抗生素杂志. 2005(08)
[6]丝状微生物形态分析方法及影响形态的因素[J]. 李晓静,阳葵,冯霞.  化学工业与工程. 2002(03)

硕士论文
[1]农用抗生素尼莫克汀高产菌株的推理选育[D]. 王则.东北农业大学 2009



本文编号：3034534