动态分子开关调控大肠杆菌生产莽草酸和葡萄糖二酸
发布时间：2021-02-22 10:42
生长偶联型启动子具有在对数期高强度表达,进入稳定期后停止表达的特点。本研究以生长偶联型启动子和降解标签组建动态下调开关,以生长偶联型启动子（GPP）、阻遏蛋白、降解标签（ssrA）为基础构建动态上调开关,在成功构建动态上调开关和动态下调开关的基础上,将两种开关合并,以正交的方式分别对两种目的蛋白同时实现上调和下调。莽草酸是大肠杆菌合成芳香族氨基酸的中间代谢物,也是抗流感药物“达菲”的重要前体。葡萄糖二酸是合成多种高效环保的新兴生物质能源的原料,具有巨大的潜在经济价值。而莽草酸和葡萄糖二酸在生物合成中,面临着合成路径与细胞生长竞争前体物质的问题。因此本研究使用分子开关将细胞生长与产物合成解偶联,实现碳代谢流的自主分配。然后应用到大肠杆菌的内源代谢路径中生产莽草酸,和外源代谢路径中生产葡萄糖二酸。主要结果如下所示:1.首先构建生长偶联型启动子文库,以启动子相对活性的峰值为评测标准,最终选择不同强度的启动子rpsL、rpsT P1、rpsA P1、rrnA P1和rrnC P1用于分子开关的组建。构建由ssrA降解标签组成的文库,以降解速率为降解标签的评测标准,选择不同强度的降解标签LAA、...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
莽草酸和奥司他韦结构式Fig.1-1Thestructuralformulaofshikimicacidandoseltamivir
第一章绪论21.1.3莽草酸的代谢工程策略目前，通过发酵生产莽草酸可满足当前约30%的需求。莽草酸途径如图1-2所示，该代谢途径用于合成生长必需的芳香族氨基酸。莽草酸途径以磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)作为前体物质，PEP通过糖酵解途径产生，而戊糖磷酸途径用于产生E4P。莽草酸途径依赖于糖酵解途径和磷酸戊糖途径来提供其所需的两种前体，仅进行单一的代谢工程改造可能不足以增加莽草酸的产量。通过糖酵解和戊糖磷酸途径产生的E4P和PEP，将通过DAHP合酶的作用在莽草酸途径中缩合，从而产生3-脱氧-D-阿拉伯糖庚酸7-磷酸(DAHP)。DAHP合酶分别由aroF，aroG，aroH编码，分别接受来自三种芳族氨基酸即L-酪氨酸，L-苯丙氨酸和L-色氨酸的反馈抑制。然后，3-脱氢奎尼酸合酶(DHQ合酶，aroB编码)将DAHP转化为3-脱氢奎尼酸(DHQ)，3-脱氢奎尼酸脱水酶(DHQ脱水酶，aroD编码)通过脱水作用将DHQ转化为3-脱氢莽草酸(DHS)，然后在莽草酸脱氢酶(aroE编码)的作用下将转化为莽草酸。莽草酸激酶(aroL和aroK编码同工酶)负责将莽草酸转化为莽草酸-3-磷酸。鸟苷酸是莽草酸途径的最终产物，该化合物是其他芳香族产物(例如芳香族氨基酸)生物合成的常见前体[17]。大肠杆菌莽草酸途径的限速酶是DAHP合酶、DHQ合酶和莽草酸激酶。图1-2莽草酸途径示意图Fig.1-2Schematicdiagramoftheshikimicacidpathway注：aroG，编码DAHP合酶；aroD，编码DHQ脱水酶；aroE，编码莽草酸脱氢酶；aroK/aroL，编码莽草酸激酶I/II；PYR，丙酮酸；G6P，葡萄糖-6-磷酸；PEP，磷酸烯醇丙酮酸；E4P，4-磷酸赤藓糖；DAHP，3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酸-7-磷酸；DHQ，3-脱氢奎宁酸；DHS，3-脱氢莽草酸；SA，莽草酸；S3P，莽草酸-3-磷酸；CHA，分支酸。Draths和Krmer等人通过代谢工程手段对?
第一章绪论4图1-3葡萄糖二酸结构式Fig.1-3Thestructuralformulaofglucaricacid1.2.2葡萄糖二酸的化学合成策略葡萄糖二酸是具有四个手性碳的高度官能化的化合物，可以通过葡萄糖的化学氧化合成[35]。由葡萄糖制备葡萄糖二酸的方法是将末端的醛基和伯羟基氧化为羧基，而其它的4个羟基不变[36]。现有的葡萄糖二酸制备方法主要为化学法如硝酸氧化和以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)为催化剂的合成方法。使用硝酸氧化法催化葡萄糖合成葡萄糖二酸在上世纪就已被提出，因为硝酸既可作为溶剂又可作为氧化剂，且操作简单，因此该方法至今仍具有商业吸引力。但是葡萄糖二酸的得率仅为40%-45%。Tyler等人使用计算机控制的反应器，通过在封闭的反应器中调整为氧气正压条件，将D-葡萄糖和硝酸受控氧化为葡萄糖二酸，并提出一种将无机硝酸盐从有机氧化产物中分离出来的纳滤方法，将硝酸直接从有机氧化产物中分离[37]。2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)一种亚硝酰自由基，Mathias等报道了一种使用TEMPO/NaBr/NaOCl和TEMPO/NaBr/Cl2系统的新型葡萄糖二酸合成方法，以Thaburet等人的工作为基础开发一种电化学氧化方法用来减少合成葡萄糖二酸时产生不必要的副产物。最终通过优化氧化参数，例如催化剂量、pH、温度和阳极类型，葡萄糖二酸的得率可以超过85%[38]。1.2.3葡萄糖二酸的代谢工程策略因为化学合成葡萄糖二酸存在着催化剂昂贵，反应条件苛刻和转化率低等问题，使用微生物细胞工厂发酵生产葡萄糖二酸成为潜在的解决方案。在自然界中，哺乳动物体内存在天然的葡萄糖二酸合成途径。葡萄糖醛酸途径会在体内产生D-葡萄糖二酸和L-抗坏血酸。该途径是以D-半乳糖或D-葡萄糖为底物并与戊糖磷酸途径相互作用。但是，这是一条漫长的途径，由十多个转
【参考文献】：
期刊论文
[1]代谢工程改造毕赤酵母生产葡萄糖二酸[J]. 刘叶,巩旭,康振,堵国成,陈坚,华兆哲. 食品与生物技术学报. 2018(09)
[2]代谢改造酿酒酵母生产葡萄糖二酸[J]. 陈娜,林卢奇,毛银,赵运英,邓禹. 食品与发酵工业. 2018(12)
[3]构建葡萄糖二酸指示系统筛选肌醇加氧酶突变株[J]. 王毳,刘叶,巩旭,刘龙,康振. 生物工程学报. 2018(11)
[4]代谢工程改造酿酒酵母合成葡萄糖二酸[J]. 巩旭,刘叶,王毳,李江华,康振. 生物工程学报. 2017(02)
[5]大肠杆菌aroL基因敲除及其对莽草酸合成的影响[J]. 付小花,高益范,郝思捷,张伯生,任大明. 复旦学报(自然科学版). 2007(03)
博士论文
[1]合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇[D]. 刘向磊.中国医药工业研究总院 2016
硕士论文
[1]大肠杆菌利用蔗糖高效合成D-葡萄糖二酸的研究[D]. 曲亚楠.北京化工大学 2018
[2]大肠杆菌过量合成莽草酸的代谢工程[D]. 李明明.江南大学 2013
本文编号：3045870
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
莽草酸和奥司他韦结构式Fig.1-1Thestructuralformulaofshikimicacidandoseltamivir
第一章绪论21.1.3莽草酸的代谢工程策略目前，通过发酵生产莽草酸可满足当前约30%的需求。莽草酸途径如图1-2所示，该代谢途径用于合成生长必需的芳香族氨基酸。莽草酸途径以磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)作为前体物质，PEP通过糖酵解途径产生，而戊糖磷酸途径用于产生E4P。莽草酸途径依赖于糖酵解途径和磷酸戊糖途径来提供其所需的两种前体，仅进行单一的代谢工程改造可能不足以增加莽草酸的产量。通过糖酵解和戊糖磷酸途径产生的E4P和PEP，将通过DAHP合酶的作用在莽草酸途径中缩合，从而产生3-脱氧-D-阿拉伯糖庚酸7-磷酸(DAHP)。DAHP合酶分别由aroF，aroG，aroH编码，分别接受来自三种芳族氨基酸即L-酪氨酸，L-苯丙氨酸和L-色氨酸的反馈抑制。然后，3-脱氢奎尼酸合酶(DHQ合酶，aroB编码)将DAHP转化为3-脱氢奎尼酸(DHQ)，3-脱氢奎尼酸脱水酶(DHQ脱水酶，aroD编码)通过脱水作用将DHQ转化为3-脱氢莽草酸(DHS)，然后在莽草酸脱氢酶(aroE编码)的作用下将转化为莽草酸。莽草酸激酶(aroL和aroK编码同工酶)负责将莽草酸转化为莽草酸-3-磷酸。鸟苷酸是莽草酸途径的最终产物，该化合物是其他芳香族产物(例如芳香族氨基酸)生物合成的常见前体[17]。大肠杆菌莽草酸途径的限速酶是DAHP合酶、DHQ合酶和莽草酸激酶。图1-2莽草酸途径示意图Fig.1-2Schematicdiagramoftheshikimicacidpathway注：aroG，编码DAHP合酶；aroD，编码DHQ脱水酶；aroE，编码莽草酸脱氢酶；aroK/aroL，编码莽草酸激酶I/II；PYR，丙酮酸；G6P，葡萄糖-6-磷酸；PEP，磷酸烯醇丙酮酸；E4P，4-磷酸赤藓糖；DAHP，3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酸-7-磷酸；DHQ，3-脱氢奎宁酸；DHS，3-脱氢莽草酸；SA，莽草酸；S3P，莽草酸-3-磷酸；CHA，分支酸。Draths和Krmer等人通过代谢工程手段对?
第一章绪论4图1-3葡萄糖二酸结构式Fig.1-3Thestructuralformulaofglucaricacid1.2.2葡萄糖二酸的化学合成策略葡萄糖二酸是具有四个手性碳的高度官能化的化合物，可以通过葡萄糖的化学氧化合成[35]。由葡萄糖制备葡萄糖二酸的方法是将末端的醛基和伯羟基氧化为羧基，而其它的4个羟基不变[36]。现有的葡萄糖二酸制备方法主要为化学法如硝酸氧化和以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)为催化剂的合成方法。使用硝酸氧化法催化葡萄糖合成葡萄糖二酸在上世纪就已被提出，因为硝酸既可作为溶剂又可作为氧化剂，且操作简单，因此该方法至今仍具有商业吸引力。但是葡萄糖二酸的得率仅为40%-45%。Tyler等人使用计算机控制的反应器，通过在封闭的反应器中调整为氧气正压条件，将D-葡萄糖和硝酸受控氧化为葡萄糖二酸，并提出一种将无机硝酸盐从有机氧化产物中分离出来的纳滤方法，将硝酸直接从有机氧化产物中分离[37]。2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)一种亚硝酰自由基，Mathias等报道了一种使用TEMPO/NaBr/NaOCl和TEMPO/NaBr/Cl2系统的新型葡萄糖二酸合成方法，以Thaburet等人的工作为基础开发一种电化学氧化方法用来减少合成葡萄糖二酸时产生不必要的副产物。最终通过优化氧化参数，例如催化剂量、pH、温度和阳极类型，葡萄糖二酸的得率可以超过85%[38]。1.2.3葡萄糖二酸的代谢工程策略因为化学合成葡萄糖二酸存在着催化剂昂贵，反应条件苛刻和转化率低等问题，使用微生物细胞工厂发酵生产葡萄糖二酸成为潜在的解决方案。在自然界中，哺乳动物体内存在天然的葡萄糖二酸合成途径。葡萄糖醛酸途径会在体内产生D-葡萄糖二酸和L-抗坏血酸。该途径是以D-半乳糖或D-葡萄糖为底物并与戊糖磷酸途径相互作用。但是，这是一条漫长的途径，由十多个转
【参考文献】：
期刊论文
[1]代谢工程改造毕赤酵母生产葡萄糖二酸[J]. 刘叶,巩旭,康振,堵国成,陈坚,华兆哲. 食品与生物技术学报. 2018(09)
[2]代谢改造酿酒酵母生产葡萄糖二酸[J]. 陈娜,林卢奇,毛银,赵运英,邓禹. 食品与发酵工业. 2018(12)
[3]构建葡萄糖二酸指示系统筛选肌醇加氧酶突变株[J]. 王毳,刘叶,巩旭,刘龙,康振. 生物工程学报. 2018(11)
[4]代谢工程改造酿酒酵母合成葡萄糖二酸[J]. 巩旭,刘叶,王毳,李江华,康振. 生物工程学报. 2017(02)
[5]大肠杆菌aroL基因敲除及其对莽草酸合成的影响[J]. 付小花,高益范,郝思捷,张伯生,任大明. 复旦学报(自然科学版). 2007(03)
博士论文
[1]合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇[D]. 刘向磊.中国医药工业研究总院 2016
硕士论文
[1]大肠杆菌利用蔗糖高效合成D-葡萄糖二酸的研究[D]. 曲亚楠.北京化工大学 2018
[2]大肠杆菌过量合成莽草酸的代谢工程[D]. 李明明.江南大学 2013
本文编号：3045870
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