纤维素酶辅助酶AA9的毕赤酵母外源表达及其初步应用
发布时间：2021-02-24 05:50
纤维素是地球上丰富的可再生资源,其发酵生产的生物质燃料对解决目前能源问题具有十分重要意义。然而纤维素酶水解效率较低,极大地限制了纤维素在酶解发酵方面的高效应用。近年许多研究发现,溶解性多糖单加氧酶家族Auxiliary Activity 9（AA9）对纤维素的水解具有明显促进作用,这为AA9作为纤维素酶辅助酶用于纤维素高效水解提供了一种可能。基于此,本文尝试开展辅助酶AA9的构建表达和应用于纤维素水解的研究,主要研究内容如下:论文首先通过密码子优化和抗性筛选,获得两株异源表达AA9的单质粒重组毕赤酵母菌株P.pastoris/pPIC9K-gh61和P.pastoris/pPICZαA-gh61;通过进一步优化,获得双质粒整合重组菌株P.pastoris GS115-D-gh61,其表达量提高20%。实验考察AA9的酶学性质发现其最适反应温度为60℃,最适反应pH 6.0,5 mmol.L-1的Co2+、Ba2+和Cu2+对酶活促进作用最明显（分别提高39%、51%和19%）。接着,实验分别对三株重...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
纤维素结构以及氢键网络示意图
图 1-2AA9 蛋白结构以及反应过程(a) AA9 蛋白结构 (b) AA9 催化反应过程Fig.1-2 The protein structure of AA9 and reaction mechanism.(a) The protein structure of AA9 (b) The catalytic reaction mechanism of AA9根据 AA9 氧化酶切纤维素不同位置碳键，Moses 将 AA9 分为 3 类，分别为 PMO1(Polysaccharide monooxygenase 1) 、PMO2 (Polysaccharide monooxygenase 2) 和 PMO3(Polysaccharide monooxygenase 3)[20]。如图 1-3 所示，PMO1 切断吡喃糖残基 C1 键，形成不稳定的 1,5- -内酯且在水中会被分解成醛糖酸；PMO2 切断吡喃糖残基 C4 键生成4-酮醛糖，生成的产物在水溶液中以相应水合物形式存在，而且氧化后形成的低聚糖容易在碱性条件下发生异构化[21-23]；PMO3 非特异性生成醛糖酸内酯或者 4-酮醛糖。AA9活性中心表面分布着裸露的芳香族氨基酸残基，研究者通过比较芳香族氨基酸残基含量发现 PMO1 蛋白结构域中芳香族氨基酸残基含量最多，PMO2 含量最少。芳香族氨基酸残基被认为是 AA9 与纤维素相互作用的至关重要结构，因此芳香族氨基酸含量差异也是造成它们活性差异较大的主要原因之一。
图 1-2AA9 蛋白结构以及反应过程(a) AA9 蛋白结构 (b) AA9 催化反应过程Fig.1-2 The protein structure of AA9 and reaction mechanism.(a) The protein structure of AA9 (b) The catalytic reaction mechanism of AA9 AA9 氧化酶切纤维素不同位置碳键，Moses 将 AA9 分为 3 类，分别为haride monooxygenase 1) 、PMO2 (Polysaccharide monooxygenase 2) 和 haride monooxygenase 3)[20]。如图 1-3 所示，PMO1 切断吡喃糖残基 C1 的 1,5- -内酯且在水中会被分解成醛糖酸；PMO2 切断吡喃糖残基 C4 键，生成的产物在水溶液中以相应水合物形式存在，而且氧化后形成的低聚条件下发生异构化[21-23]；PMO3 非特异性生成醛糖酸内酯或者 4-酮醛糖表面分布着裸露的芳香族氨基酸残基，研究者通过比较芳香族氨基酸残基O1 蛋白结构域中芳香族氨基酸残基含量最多，PMO2 含量最少。芳香族氨为是 AA9 与纤维素相互作用的至关重要结构，因此芳香族氨基酸含量差们活性差异较大的主要原因之一。
【参考文献】：
期刊论文
[1]裂解多糖单加氧酶高效催化的研究进展[J]. 李欣,张丽丽,田莉,张怀强,陈冠军,王禄山. 生物化学与生物物理进展. 2016(10)
[2]纤维素乙醇关键技术及进展[J]. 林鑫,武国庆. 生物产业技术. 2015(02)
[3]里氏木霉GH61家族糖苷酶的高效表达及酶学特性研究[J]. 冯飞,王绍文,王娟,刘刚. 微生物学通报. 2014(07)
[4]Actinosynnema mirum DSM43827溶解性多糖单加氧酶的异源表达和酶学性质表征[J]. 施贤卫,张伟涛,张小飞,杨广宇,冯雁. 中国生物工程杂志. 2014(07)
[5]重组毕赤酵母发酵产纤维二糖酶[J]. 冀彤,王冰冰,夏黎明. 食品与发酵工业. 2011(05)
[6]碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化[J]. 田生礼,邵睿,刘刚,孔舒. 中国生物制品学杂志. 2009(05)
[7]阿魏酸酯酶和纤维素酶在水解汽爆稻草中的协同作用[J]. 曾薇,陈洪章. 生物工程学报. 2009(01)
[8]巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略[J]. 胡世界,罗素兰,张吉贞,长孙东亭. 生物技术. 2007(06)
[9]毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用[J]. 张伍魁,范清林,宋礼华. 中国生物工程杂志. 2006(01)
[10]毕赤酵母表达外源基因研究进展[J]. 王勇. 微生物学免疫学进展. 2004(01)
博士论文
[1]毕赤酵母AOX1启动子转录调控机制研究[D]. 王小龙.华东理工大学 2016
[2]β-甘露聚糖酶的基因克隆、分子改造及低聚甘露糖的酶法制备[D]. 唐存多.江南大学 2013
[3]纤维素酶系在大肠杆菌中的构建及改造[D]. 刘敏.浙江大学 2013
硕士论文
[1]嗜热子囊菌热稳定多糖单加氧酶的基因克隆、表达及其性质研究[D]. 陈铭.山东农业大学 2017
[2]木霉属纤维素酶基因在毕赤酵母表达及在统合工艺中应用[D]. 何文静.暨南大学 2016
[3]里氏木霉Cel5A和Cel6A的毕赤酵母异源表达[D]. 白仁惠.江南大学 2016
[4]木聚糖水解酶XynC和Xy143的双质粒重组毕赤酵母异源表达[D]. 张云博.江南大学 2016
[5]GH45家族纤维素酶基因的挖掘及高效表达[D]. 郭超.天津科技大学 2016
[6]重组毕赤酵母高效表达细菌亮氨酸氨肽酶及发酵优化[D]. 席宏星.江南大学 2015
[7]高效水解甘油有机溶剂预处理麦草纤维素酶制剂的选择和复配[D]. 谭玲.江南大学 2015
[8]来源于Aspergillus niger的阿魏酸酯酶在毕赤酵母GS115中的表达及其酶学性质的研究[D]. 陈云华.华侨大学 2015
[9]AA10家族溶解性多糖单加氧酶的克隆表达和性质研究[D]. 施贤卫.上海交通大学 2014
本文编号：3048893
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
纤维素结构以及氢键网络示意图
图 1-2AA9 蛋白结构以及反应过程(a) AA9 蛋白结构 (b) AA9 催化反应过程Fig.1-2 The protein structure of AA9 and reaction mechanism.(a) The protein structure of AA9 (b) The catalytic reaction mechanism of AA9根据 AA9 氧化酶切纤维素不同位置碳键，Moses 将 AA9 分为 3 类，分别为 PMO1(Polysaccharide monooxygenase 1) 、PMO2 (Polysaccharide monooxygenase 2) 和 PMO3(Polysaccharide monooxygenase 3)[20]。如图 1-3 所示，PMO1 切断吡喃糖残基 C1 键，形成不稳定的 1,5- -内酯且在水中会被分解成醛糖酸；PMO2 切断吡喃糖残基 C4 键生成4-酮醛糖，生成的产物在水溶液中以相应水合物形式存在，而且氧化后形成的低聚糖容易在碱性条件下发生异构化[21-23]；PMO3 非特异性生成醛糖酸内酯或者 4-酮醛糖。AA9活性中心表面分布着裸露的芳香族氨基酸残基，研究者通过比较芳香族氨基酸残基含量发现 PMO1 蛋白结构域中芳香族氨基酸残基含量最多，PMO2 含量最少。芳香族氨基酸残基被认为是 AA9 与纤维素相互作用的至关重要结构，因此芳香族氨基酸含量差异也是造成它们活性差异较大的主要原因之一。
图 1-2AA9 蛋白结构以及反应过程(a) AA9 蛋白结构 (b) AA9 催化反应过程Fig.1-2 The protein structure of AA9 and reaction mechanism.(a) The protein structure of AA9 (b) The catalytic reaction mechanism of AA9 AA9 氧化酶切纤维素不同位置碳键，Moses 将 AA9 分为 3 类，分别为haride monooxygenase 1) 、PMO2 (Polysaccharide monooxygenase 2) 和 haride monooxygenase 3)[20]。如图 1-3 所示，PMO1 切断吡喃糖残基 C1 的 1,5- -内酯且在水中会被分解成醛糖酸；PMO2 切断吡喃糖残基 C4 键，生成的产物在水溶液中以相应水合物形式存在，而且氧化后形成的低聚条件下发生异构化[21-23]；PMO3 非特异性生成醛糖酸内酯或者 4-酮醛糖表面分布着裸露的芳香族氨基酸残基，研究者通过比较芳香族氨基酸残基O1 蛋白结构域中芳香族氨基酸残基含量最多，PMO2 含量最少。芳香族氨为是 AA9 与纤维素相互作用的至关重要结构，因此芳香族氨基酸含量差们活性差异较大的主要原因之一。
【参考文献】：
期刊论文
[1]裂解多糖单加氧酶高效催化的研究进展[J]. 李欣,张丽丽,田莉,张怀强,陈冠军,王禄山. 生物化学与生物物理进展. 2016(10)
[2]纤维素乙醇关键技术及进展[J]. 林鑫,武国庆. 生物产业技术. 2015(02)
[3]里氏木霉GH61家族糖苷酶的高效表达及酶学特性研究[J]. 冯飞,王绍文,王娟,刘刚. 微生物学通报. 2014(07)
[4]Actinosynnema mirum DSM43827溶解性多糖单加氧酶的异源表达和酶学性质表征[J]. 施贤卫,张伟涛,张小飞,杨广宇,冯雁. 中国生物工程杂志. 2014(07)
[5]重组毕赤酵母发酵产纤维二糖酶[J]. 冀彤,王冰冰,夏黎明. 食品与发酵工业. 2011(05)
[6]碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化[J]. 田生礼,邵睿,刘刚,孔舒. 中国生物制品学杂志. 2009(05)
[7]阿魏酸酯酶和纤维素酶在水解汽爆稻草中的协同作用[J]. 曾薇,陈洪章. 生物工程学报. 2009(01)
[8]巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略[J]. 胡世界,罗素兰,张吉贞,长孙东亭. 生物技术. 2007(06)
[9]毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用[J]. 张伍魁,范清林,宋礼华. 中国生物工程杂志. 2006(01)
[10]毕赤酵母表达外源基因研究进展[J]. 王勇. 微生物学免疫学进展. 2004(01)
博士论文
[1]毕赤酵母AOX1启动子转录调控机制研究[D]. 王小龙.华东理工大学 2016
[2]β-甘露聚糖酶的基因克隆、分子改造及低聚甘露糖的酶法制备[D]. 唐存多.江南大学 2013
[3]纤维素酶系在大肠杆菌中的构建及改造[D]. 刘敏.浙江大学 2013
硕士论文
[1]嗜热子囊菌热稳定多糖单加氧酶的基因克隆、表达及其性质研究[D]. 陈铭.山东农业大学 2017
[2]木霉属纤维素酶基因在毕赤酵母表达及在统合工艺中应用[D]. 何文静.暨南大学 2016
[3]里氏木霉Cel5A和Cel6A的毕赤酵母异源表达[D]. 白仁惠.江南大学 2016
[4]木聚糖水解酶XynC和Xy143的双质粒重组毕赤酵母异源表达[D]. 张云博.江南大学 2016
[5]GH45家族纤维素酶基因的挖掘及高效表达[D]. 郭超.天津科技大学 2016
[6]重组毕赤酵母高效表达细菌亮氨酸氨肽酶及发酵优化[D]. 席宏星.江南大学 2015
[7]高效水解甘油有机溶剂预处理麦草纤维素酶制剂的选择和复配[D]. 谭玲.江南大学 2015
[8]来源于Aspergillus niger的阿魏酸酯酶在毕赤酵母GS115中的表达及其酶学性质的研究[D]. 陈云华.华侨大学 2015
[9]AA10家族溶解性多糖单加氧酶的克隆表达和性质研究[D]. 施贤卫.上海交通大学 2014
本文编号：3048893
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