产乳糖酶基因工程菌的构建及发酵条件优化

发布时间：2021-02-26 18:09

　　乳糖酶又称β-D半乳糖苷酶,可以水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖,并具有半乳糖苷转移作用。乳糖酶作为一种生物酶制剂,在医药上主要用来治疗乳糖不耐受症;在食品工业上主要添加在乳制品中制成低乳糖奶制品。针对目前乳糖酶工业化中生产存在的问题,如产酶量低、胞内分泌,回收率低等,结合现代基因工程技术,选取米曲霉乳糖酶为目的基因,乳酸克鲁维酵母GG799为宿主细胞,重组构建一株可胞外分泌、酶学性质好、表达水平高的新型产乳糖酶工程菌株。根据乳酸克鲁维酵母密码子的偏爱性,在不改变原氨基酸序列的前提下,以米曲霉乳糖酶基因为模板,对米曲霉乳糖酶基因序列人工合成并进行优化。优化后的乳糖酶基因lacA序列全长2982 bp,GC含量由原来的51.4%降低到39.2%,共改变了基因序列中的678个基因位点,高频密码子大幅度增加。将优化后的乳糖酶基因序列lacA连接至pKLAC1载体的XhoⅠ/BglⅡ位点之间构建载体pKLAC1-lacA,用电脉冲法将经SacⅡ线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中,酵母基本碳源培养基YCB富集得到大量转化子。经过多次电转,筛选出一株可高效分泌表达乳糖酶的重组酵母工程菌株l... 

【文章来源】：南阳师范学院河南省

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

乳糖酶的水解反应图

条件下酶活力保持时间较长，低温保存 30 d 酶活性仍5]。但原始米曲霉菌株所产的乳糖酶酶活性都较低，欧分泌的乳糖酶进行研究，培养基优化后测得乳糖酶的活力较低。本研究结合基因工程技术，以乳酸克鲁维酵乳糖酶基因，并根据乳酸克鲁维酵母密码子的偏爱性乳糖酶基因序列构建到载体 pKLAC1 中，将重组载母中，进行平板筛选、PCR 验证、SDS-PAGE 电泳分株可高效表达乳糖酶的重组菌株。达载体799 由本实验室保存，载体 pKLAC1 图谱如图 2-1 所

2-3 The absorbance values of different concentration of ONP at苯酚的浓度为纵坐标，稀释液在 420 nm 处吸光值为横坐线，结果如图 2-2 所示。序号 浓度（mmol/L） A4201234567800.020.040.060.080.100.120.1400.0880.1770.2670.3530.4410.5270.601

【参考文献】：
期刊论文
[1]婴儿乳糖不耐受病因研究及防治进展[J]. 俞栋,叶环.  预防医学. 2018(08)
[2]一株嗜热链球菌乳糖酶的分离纯化及酶学特性研究[J]. 曹永强,余志坚,陈超,张健,杨贞耐.  食品科学技术学报. 2018(02)
[3]儿童乳糖不耐受症的诊断与治疗进展[J]. 陶东亚,苏述平.  现代医药卫生. 2018(06)
[4]骆驼凝乳酶原基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达[J]. 徐龙龙,刘思彤,任永成,惠丰立.  中国食品学报. 2017(12)
[5]微生物乳糖酶研究进展[J]. 贺璐,龙承星,刘又嘉,惠华英,谭周进.  食品与发酵工业. 2017(06)
[6]乳糖酶的固定化及其应用研究进展[J]. 李晶,王存芳.  乳业科学与技术. 2016(06)
[7]乳糖酶活性检测方法研究进展[J]. 惠华英,黄莺,雷志丹,张晓青,谭周进.  中国微生态学杂志. 2016(09)
[8]响应面分析法优化乳糖酶发酵培养基[J]. 赵从波,章淑艳,罗同阳,李宾.  中国乳品工业. 2014(04)
[9]乳酸克鲁维酵母的发酵优势及在食品酶制剂领域中的应用[J]. 王玉海,张慧斌,杨慧敏,孟青青,王凤寰.  中国生物工程杂志. 2013(12)
[10]肠道乳糖酶的研究进展[J]. 谭周进,郭抗萧,曾奥,郭照辉,王欢.  世界华人消化杂志. 2013(28)

博士论文
[1]乳酸克鲁维酵母表达异源木聚糖酶B工程菌改造及蛋白分泌机制研究[D]. 连昭.中国农业大学 2015
[2]产乳糖酶酵母菌株的遗传改良和乳糖酶的发酵生产[D]. 徐金利.中国海洋大学 2012

硕士论文
[1]基因工程技术生产乳糖酶的研究[D]. 张霞.北京化工大学 2015
[2]米曲霉乳糖酶的发酵条件及酶学性质的研究[D]. 山琳.甘肃农业大学 2014
[3]马克斯克鲁维酵母菌乳糖酶基因的高效表达和高活力乳糖酶的生产[D]. 毕海洋.中国海洋大学 2014
[4]凝结芽孢杆菌耐热乳糖酶基因的原核表达及酶学性质研究[D]. 吴琼.大连工业大学 2012
[5]米曲霉生产乳糖酶的研究[D]. 欧军.东北林业大学 2008
[6]黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D]. 李淑娟.河北农业大学 2007



本文编号：3052967