甘露糖-6-磷酸的合成工艺研究
发布时间：2021-03-05 05:56
甘露糖-6-磷酸（M6P）涉及生命中的许多代谢途径,在疾病治疗中具有重要的应用。本论文的主要研究内容是开发一种合成甘露糖-6-磷酸的新方法,创造了一种利用多磷酸盐依赖型甘露糖激酶合成甘露糖-6-磷酸的酶催化合成方法。本论文的合成方式相比于化学合成法更加安全、更加绿色,且替代了传统且昂贵的磷酸盐供体:ATP。论文的主要研究内容包括以下几个方面:基因工程菌的构建、单因素变量对甘露糖-6-磷酸合成的影响、响应面法优化合成反应、工艺的中试放大等几个方面,具体工作与研究结果如下:（1）该课题成功构建了异源表达载体,克隆了来自节杆菌（Arthrobactersp）KM菌株的多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶（PPGMK）基因,在大肠杆菌中实现了多聚磷酸盐依赖型激酶的异源表达,命名为L7,成功实现了体外合成甘露糖-6-磷酸。（2）利用单因素实验探究各种条件对于转化率的影响,对合成反应进行初步的优化,发现温度在30℃、Mg2+浓度>10 mM、甘露糖添加量在2%、六偏磷酸钠添加量为20 g/L时,酶催化反应具有较高的转化率。同时发现Mg2+与Mn2+是比较适合的作为辅因子,六偏磷酸钠与ATP 比较适合作...
【文章来源】：北京化工大学北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１甘露糖－６－磷酸??Ｆｉｇ．１－１?Ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ??
?北京化工大学硕士论文???Ｉ??图２－２?Ｌ７诱导表达蛋白电泳??１和２：?Ｌ７粗酶液，Ｍ：标准蛋白??Ｆｉｇ．?２－２?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｏｆ?ｐＥＴ２８ａ－／７??１?ａｎｄ?２：?Ｌ７?ｃｒｕｄｅ?ｅｎｚｙｍｅ，?Ｍ：?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ??２．４．３薄层结果验证??薄层层析法体系选择异丙醇、水和冰醋酸做为展开剂，可以对甘露糖－６－磷酸??和甘露糖进行分离，并定性检测。如图２－３所示，ｌａｎｅｌ和ｌａｎｅ２分别表示的是甘??露糖标品和甘露糖－６－磷酸标品的条带。从图中可以看到通过展开剂一定时间的??作用后，甘露糖与Ｍ６Ｐ随着展开剂自下而上展开，在靠近硅胶板顶端，是甘露??糖条带，这与甘露糖的极性比甘露糖－６－磷酸更大有关。ｌａｎｅ３表示的是反应液条??带，通过与ｌａｎｅｌ与ｌａｎｅ２比对发现，有甘露糖－６－磷酸生成，同时底物甘露糖并??没有消耗完全，留有条带。说明在２．３．５的反应体系下，反应时间内转化率并没??有达到１００％。薄层层析实验证明了?Ｌ７酶异源表达成功，并且拥有生物催化活??性。??２０??
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【参考文献】：
期刊论文
[1]响应面法在试验设计与优化中的应用[J]. 李莉,张赛,何强,胡学斌. 实验室研究与探索. 2015(08)
[2]高效离子交换色谱-电化学检测法测定药物合成中间体中的6-磷酸甘露糖[J]. 潘广文,刘绿叶,叶明立,胡忠阳. 色谱. 2012(04)
[3]响应面法在试验设计与优化中的应用[J]. 张泽志,韩春亮,李成未. 河南教育学院学报(自然科学版). 2011(04)
[4]分子动力学模拟研究结构金属镁离子在GSK-3β激酶磷酸化中的作用（英文）[J]. 孙浩,蒋勇军,俞庆森,高慧. 物理化学学报. 2011(01)
[5]响应面法在生物过程优化中的应用[J]. 田泱源,李瑞芳. 食品工程. 2010(02)
[6]壳寡糖的薄层层析分析[J]. 陈小娥,方旭波,余辉,廖智. 浙江海洋学院学报(自然科学版). 2008(04)
[7]响应面法优化纳豆激酶液体发酵[J]. 胡升,梅乐和,姚善泾. 食品与发酵工业. 2003(01)
[8]高效液相色谱法测定魔芋葡甘露聚糖[J]. 谢小波,李桂贞. 华东理工大学学报. 2002(04)
[9]结缔组织生长因子诱导肾成纤维细胞转为成肌纤维细胞[J]. 黄海长,李惊子,王海燕. 科学通报. 2002(01)
[10]银杏叶聚戊烯醇化学研究[J]. 王成章,沈兆邦,陈祥. 林产化学与工业. 1992(04)
硕士论文
[1]葡萄糖-1-磷酸高产菌株的选育及发酵条件优化[D]. 许向华.吉林农业大学 2011
[2]响应面法在生物过程优化中的应用[D]. 黄新仁.湖南大学 2011
[3]水产品中多聚磷酸盐离子色谱检测方法的建立及无磷保水剂的初步研究[D]. 张丽.浙江工商大学 2011
本文编号：3064695
【文章来源】：北京化工大学北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１甘露糖－６－磷酸??Ｆｉｇ．１－１?Ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ??
?北京化工大学硕士论文???Ｉ??图２－２?Ｌ７诱导表达蛋白电泳??１和２：?Ｌ７粗酶液，Ｍ：标准蛋白??Ｆｉｇ．?２－２?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｏｆ?ｐＥＴ２８ａ－／７??１?ａｎｄ?２：?Ｌ７?ｃｒｕｄｅ?ｅｎｚｙｍｅ，?Ｍ：?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ??２．４．３薄层结果验证??薄层层析法体系选择异丙醇、水和冰醋酸做为展开剂，可以对甘露糖－６－磷酸??和甘露糖进行分离，并定性检测。如图２－３所示，ｌａｎｅｌ和ｌａｎｅ２分别表示的是甘??露糖标品和甘露糖－６－磷酸标品的条带。从图中可以看到通过展开剂一定时间的??作用后，甘露糖与Ｍ６Ｐ随着展开剂自下而上展开，在靠近硅胶板顶端，是甘露??糖条带，这与甘露糖的极性比甘露糖－６－磷酸更大有关。ｌａｎｅ３表示的是反应液条??带，通过与ｌａｎｅｌ与ｌａｎｅ２比对发现，有甘露糖－６－磷酸生成，同时底物甘露糖并??没有消耗完全，留有条带。说明在２．３．５的反应体系下，反应时间内转化率并没??有达到１００％。薄层层析实验证明了?Ｌ７酶异源表达成功，并且拥有生物催化活??性。??２０??
?第二章？基因工程菌的构建???ｒｍ??Ｍａｎｎｏｓｅ??ｃ｜??■?Ｍ６Ｆ?■??ＬＩ??图２－３?Ｌ７薄层层析结果??１：甘露糖标品，２：甘露糖－６－磷酸标品，３：反应液??Ｆｉｇ．?２－３?ＴＬＣ?ｏｆ?ｐＥＴ２８ａ－／７??１：?ｍａｎｎｏｓｅ?ｍａｒｋｅｒ，?２：?ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ｍａｒｋｅｒ，?３：?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｌｉｑｕｉｄ??２．４．４核磁结果验证??在核磁共振仪中，氢原子的跃迁信号可以被记录，由于不同位置的氢原子产??生的共振频率不同，在光谱上就具有不同的位置。就可以利用峰面积和化学位移??等信息帮助推断其在化合物中的位置。如图２－４所示，图为酶反应后产物的图谱，??首先，峰的数目可以表示该产物的氢原子种类；而峰面积可以表示该产物中氢原??子的相对数目。通过比对后发现，甘露糖－６－磷酸的氢原子信息与谱图一一对应，??该方法从另一个角度说明了?Ｌ７酶具有生物催化活性，产物是甘露糖－６－磷酸。??２１??
【参考文献】：
期刊论文
[1]响应面法在试验设计与优化中的应用[J]. 李莉,张赛,何强,胡学斌. 实验室研究与探索. 2015(08)
[2]高效离子交换色谱-电化学检测法测定药物合成中间体中的6-磷酸甘露糖[J]. 潘广文,刘绿叶,叶明立,胡忠阳. 色谱. 2012(04)
[3]响应面法在试验设计与优化中的应用[J]. 张泽志,韩春亮,李成未. 河南教育学院学报(自然科学版). 2011(04)
[4]分子动力学模拟研究结构金属镁离子在GSK-3β激酶磷酸化中的作用（英文）[J]. 孙浩,蒋勇军,俞庆森,高慧. 物理化学学报. 2011(01)
[5]响应面法在生物过程优化中的应用[J]. 田泱源,李瑞芳. 食品工程. 2010(02)
[6]壳寡糖的薄层层析分析[J]. 陈小娥,方旭波,余辉,廖智. 浙江海洋学院学报(自然科学版). 2008(04)
[7]响应面法优化纳豆激酶液体发酵[J]. 胡升,梅乐和,姚善泾. 食品与发酵工业. 2003(01)
[8]高效液相色谱法测定魔芋葡甘露聚糖[J]. 谢小波,李桂贞. 华东理工大学学报. 2002(04)
[9]结缔组织生长因子诱导肾成纤维细胞转为成肌纤维细胞[J]. 黄海长,李惊子,王海燕. 科学通报. 2002(01)
[10]银杏叶聚戊烯醇化学研究[J]. 王成章,沈兆邦,陈祥. 林产化学与工业. 1992(04)
硕士论文
[1]葡萄糖-1-磷酸高产菌株的选育及发酵条件优化[D]. 许向华.吉林农业大学 2011
[2]响应面法在生物过程优化中的应用[D]. 黄新仁.湖南大学 2011
[3]水产品中多聚磷酸盐离子色谱检测方法的建立及无磷保水剂的初步研究[D]. 张丽.浙江工商大学 2011
本文编号：3064695
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