定向进化L—氨基酸脱氨酶转化合成α—酮戊二酸
发布时间：2021-03-24 15:07
α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid,α-KG）是一种二元短链羧酸,也是连接碳-氮代谢的关键节点,是微生物体内多种化合物的重要前体,广泛应用于食品、医药、精细化工等领域。目前,α-KG的生产制备方法主要有化学合成法、微生物发酵法和酶催化转化法。其中,化学合成法使用大量有害试剂,严重污染环境且限制其在食品等行业的应用。微生物发酵法存在副产物过多,发酵周期长等弊端。酶催化转化法具有催化反应条件温和、转化率高、反应副产物少,产物易分离等优点,适合α-KG的生产。本研究利用异源表达来源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶基因（pm1）的E.coli BL21（DE3）重组菌株催化底物L-谷氨酸钠合成产物α-KG,并从分子改造、表达载体优化、摇瓶和罐上发酵及全细胞转化条件优化等方面提高L-氨基酸脱氨酶合成α-KG的效率。论文主要内容如下:（1）将异源表达来源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶基因pm1的重组大肠杆菌E.coli BL21（pET20b-pm1）进行摇瓶上的发酵和全细胞转化的条件优化。确定最佳发酵条件为:种子培养时间10 h,诱...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
α-KG的结构式Fig.1-1Thestereochemicalstructureofα-ketoglutarate
酶作用位置是胞质，结构组成包括：FAD 结合域、帽子、螺旋Sulfolobus tokodaii 的 L-氨基酸脱氨酶作用位置是胞质，结构组帽子、螺旋域[36]；来源于普通变形杆菌 Proteus vulgaris 的 L-氨上胞外，结构组成包括 FAD 结合域、底物结合域、α+β 结构域 Proteus myxofaciens 的 L-氨基酸脱氨酶作用位置是膜上胞外[3氨酶催化的反应为氧化脱氨反应，根据产物是否存在 H2O2可类：一类产生 H2O2；另一类产生水。产生 H2O2的 L-氨基酸脱酸 Cα上的 H 转移到辅酶 FAD 上，氨基酸在水分子的作用下通的 α-酮酸和氨；FAD 获得 H 后形成 FADH2，而后被氧分子氧形成 H2O2。产生水的 L-氨基酸脱氨酶催化过程的不同之处是胞膜上的电子传递链传递至细胞色素蛋白，氧分子被还原成水]。催化过程如图 1-2 所示。产生水的一类 L-氨基酸脱氨酶由于对细胞生长影响小，相比下更利于在大肠杆菌等常用菌株中的中利用 L-氨基酸氨基酸脱氨酶催化 L-谷氨酸生成 α-KG 的反应
图 1-2 L-氨基酸脱氨酶的氧化还原反应类型Fig.1-2 The Oxidative deamination of L-amino acid deaminase
【参考文献】：
期刊论文
[1]易错PCR法提高L-氨基酸脱氨酶全细胞转化L-异亮氨酸生产α-酮-β-甲基正戊酸效率[J]. 郭濛檬,刘龙,李江华,堵国成,陈坚. 食品与生物技术学报. 2018(11)
[2]白丝北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质分析[J]. 陈稳,李由然,顾正华,丁重阳,张梁,石贵阳. 食品科学. 2018(02)
[3]定向进化技术的最新进展[J]. 曲戈,赵晶,郑平,孙际宾,孙周通. 生物工程学报. 2018(01)
[4]ɑ-酮戊二酸及其生理作用[J]. 付莹,王红权,赵玉蓉. 湖南饲料. 2017(05)
[5]蛋白质定向进化技术概述[J]. 王松明,顾招兵,朱雅新,冷静,冯励,李清,杨舒黎. 中国饲料. 2017(14)
[6]谷氨酸氧化酶高产菌株的筛选鉴定及催化生产α-酮戊二酸[J]. 刘佳,徐继嗣,罗秋玲,陈修来,刘立明. 生物加工过程. 2017(03)
[7]L-谷氨酸氧化酶高密度发酵及催化合成α-酮戊二酸[J]. 樊祥臣,陈瑞东,刘佳,徐继嗣,刘立明. 过程工程学报. 2016(02)
[8]酶法转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸[J]. 牛盼清,张震宇,刘立明. 生物工程学报. 2014(08)
[9]强化乙酰辅酶A供给对解脂亚洛酵母产α-酮戊二酸的影响[J]. 殷晓霞,堵国成,陈坚,周景文. 工业微生物. 2013 (02)
[10]高通量筛选工具的设计与应用[J]. 唐双焱,梁朝宁,蒋培霞. 生物工程学报. 2012(07)
博士论文
[1]L-氨基酸脱氨酶分子改造及生物合成α-酮异己酸[D]. 宋阳.江南大学 2018
[2]枯草芽孢杆菌尿酸氧化酶的定向进化[D]. 李文杰.中国科学技术大学 2017
硕士论文
[1]L-氨基酸脱氨酶分子改造提高α-酮异戊酸合成效率[D]. 黎若熙.江南大学 2017
[2]α-酮戊二酸工程菌构建及发酵条件控制[D]. 孙兰超.天津科技大学 2016
[3]α-酮戊二酸工程菌构建及发酵条件控制[D]. 冯甲.天津科技大学 2015
本文编号：3097937
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
α-KG的结构式Fig.1-1Thestereochemicalstructureofα-ketoglutarate
酶作用位置是胞质，结构组成包括：FAD 结合域、帽子、螺旋Sulfolobus tokodaii 的 L-氨基酸脱氨酶作用位置是胞质，结构组帽子、螺旋域[36]；来源于普通变形杆菌 Proteus vulgaris 的 L-氨上胞外，结构组成包括 FAD 结合域、底物结合域、α+β 结构域 Proteus myxofaciens 的 L-氨基酸脱氨酶作用位置是膜上胞外[3氨酶催化的反应为氧化脱氨反应，根据产物是否存在 H2O2可类：一类产生 H2O2；另一类产生水。产生 H2O2的 L-氨基酸脱酸 Cα上的 H 转移到辅酶 FAD 上，氨基酸在水分子的作用下通的 α-酮酸和氨；FAD 获得 H 后形成 FADH2，而后被氧分子氧形成 H2O2。产生水的 L-氨基酸脱氨酶催化过程的不同之处是胞膜上的电子传递链传递至细胞色素蛋白，氧分子被还原成水]。催化过程如图 1-2 所示。产生水的一类 L-氨基酸脱氨酶由于对细胞生长影响小，相比下更利于在大肠杆菌等常用菌株中的中利用 L-氨基酸氨基酸脱氨酶催化 L-谷氨酸生成 α-KG 的反应
图 1-2 L-氨基酸脱氨酶的氧化还原反应类型Fig.1-2 The Oxidative deamination of L-amino acid deaminase
【参考文献】：
期刊论文
[1]易错PCR法提高L-氨基酸脱氨酶全细胞转化L-异亮氨酸生产α-酮-β-甲基正戊酸效率[J]. 郭濛檬,刘龙,李江华,堵国成,陈坚. 食品与生物技术学报. 2018(11)
[2]白丝北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质分析[J]. 陈稳,李由然,顾正华,丁重阳,张梁,石贵阳. 食品科学. 2018(02)
[3]定向进化技术的最新进展[J]. 曲戈,赵晶,郑平,孙际宾,孙周通. 生物工程学报. 2018(01)
[4]ɑ-酮戊二酸及其生理作用[J]. 付莹,王红权,赵玉蓉. 湖南饲料. 2017(05)
[5]蛋白质定向进化技术概述[J]. 王松明,顾招兵,朱雅新,冷静,冯励,李清,杨舒黎. 中国饲料. 2017(14)
[6]谷氨酸氧化酶高产菌株的筛选鉴定及催化生产α-酮戊二酸[J]. 刘佳,徐继嗣,罗秋玲,陈修来,刘立明. 生物加工过程. 2017(03)
[7]L-谷氨酸氧化酶高密度发酵及催化合成α-酮戊二酸[J]. 樊祥臣,陈瑞东,刘佳,徐继嗣,刘立明. 过程工程学报. 2016(02)
[8]酶法转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸[J]. 牛盼清,张震宇,刘立明. 生物工程学报. 2014(08)
[9]强化乙酰辅酶A供给对解脂亚洛酵母产α-酮戊二酸的影响[J]. 殷晓霞,堵国成,陈坚,周景文. 工业微生物. 2013 (02)
[10]高通量筛选工具的设计与应用[J]. 唐双焱,梁朝宁,蒋培霞. 生物工程学报. 2012(07)
博士论文
[1]L-氨基酸脱氨酶分子改造及生物合成α-酮异己酸[D]. 宋阳.江南大学 2018
[2]枯草芽孢杆菌尿酸氧化酶的定向进化[D]. 李文杰.中国科学技术大学 2017
硕士论文
[1]L-氨基酸脱氨酶分子改造提高α-酮异戊酸合成效率[D]. 黎若熙.江南大学 2017
[2]α-酮戊二酸工程菌构建及发酵条件控制[D]. 孙兰超.天津科技大学 2016
[3]α-酮戊二酸工程菌构建及发酵条件控制[D]. 冯甲.天津科技大学 2015
本文编号：3097937
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3097937.html
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