米曲霉中性蛋白酶的分离纯化及Cu 2+ 对其酶学性质的影响
发布时间：2021-04-03 05:58
中性蛋白酶是最早用于工业生产的蛋白酶,在食品、生物和医药等方面得到广泛应用。本试验从自然发酵的霉豆瓣中分离筛选出一株高产中性蛋白酶的菌株米曲霉Y1,通过硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析两种纯化方法获得电泳级纯度的中性蛋白酶,研究发现常见金属离子能提高中性蛋白酶的酶活,其中以Cu2+激活效果最强,通过单因素试验筛选出Cu2+最适作用浓度,进一步探讨了添加Cu2+对中性蛋白酶酶学性质的影响,并探讨Cu2+对米曲霉Y1生长和产酶情况的影响。主要研究结果如下:（1）传统自然发酵的霉豆瓣作为本试验菌株的样品来源,试验共分离得到18株菌,有6株菌在中性酪蛋白培养基上产生透明圈,其中菌株Y1水解圈直径与菌落直径的比值最大,为2.54,其中性蛋白酶的酶活最高,为342.42U/mL。通过形态学对菌株Y1进行初步鉴定,采用18S rDNA片段扩增后进行序列测定,将序列测定结果与NCBI数据库进行同源性分析确定菌株Y1是米曲霉（Aspergillus oryzae）。（2）将米曲...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
酪蛋白标准曲线
蛋白酶优势菌株分离、筛选和鉴产中性蛋白酶菌株的分离筛选的半成品，其发酵过程属于多菌株复合发红曲霉和酵母菌[83-86]等真菌，本试验使用中分离得到 18 株菌，通过中性蛋白酶培养初筛从中性蛋白酶培养基上挑选出透明圈 Y2。使用点植法将两株菌分别接入中性蛋别测定菌落直径和透明圈直径，结果见表水解情况。
图 4 硫酸铵分级沉淀上清液的水解情况hydrolysis of the supernatant precipitated by ammoniumarose Fast Flow 离子交换层析和聚乙二醇 20000 浓缩后的蛋白酶样品，利用换层析进一步纯化，洗脱图谱见图 5。褐色，经过硫酸铵盐析、透析除盐和浓缩后的素，先用 pH 值为 7.0 的 Tris-HCl 缓冲液对其和杂蛋白。从样品进入填料开始，观察到大约该峰出现在 NaCl 洗脱液洗脱之前，属于流出透明，大约从 60min 开始收集管内的收集液颜到褐色色素从上往下移动直至完全洗脱出来，吸收峰，此时 NaCl 溶液洗脱浓度达到 1.6mol脱浓度达到 2.0mol/mL时，峰 2 出峰完全，
【参考文献】：
期刊论文
[1]霉豆瓣中优势微生物蛋白酶活性测定[J]. 梅源,唐佳颖,何惠容,敖晓琳. 食品与发酵工业. 2017(09)
[2]豆瓣酱制曲工艺条件优化[J]. 刘云珍,许喜林,刘永琪,刘冬梅. 中国酿造. 2016(11)
[3]一种芽孢杆菌中性蛋白酶启动子的克隆和验证[J]. 纪明华,赵利超,史吉平,孙俊松. 食品工业科技. 2016(13)
[4]枯草芽孢杆菌JNB001蛋白酶特性的研究[J]. 余全法,吴劲松,竺礼斌,王海霞,曲道峰,韩剑众. 中国畜牧兽医. 2015(12)
[5]一种米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶解特性研究[J]. 宗红,冯颖杰,陆信曜,诸葛斌,方慧英,孙进,冯倩,楼笑笑,程英雀. 食品工业科技. 2015(20)
[6]解淀粉芽孢杆菌Z16的产酶条件优化及应用[J]. 曾诚,马毛毛,肖彦骏,曾哲灵,余平,钟卫民. 食品工业科技. 2016(03)
[7]一种米曲霉蛋白酶的酶学性质及其在酪蛋白磷酸肽制备中的应用[J]. 冯颖杰,宗红,诸葛斌,方慧英,陆信曜,孙进,冯倩,丁凤姣. 微生物学通报. 2015(11)
[8]米曲霉种曲制备工艺优化研究[J]. 赵中开,林艳,杨建刚,马莹莹,林秋,吴赫川. 中国酿造. 2014(08)
[9]1398中性蛋白酶的色谱柱纯化与分子鉴定[J]. 赵忠润,陈超,黄娇芳,俞峰,史吉平,孙俊松. 生物技术进展. 2014(03)
[10]米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究[J]. 马俊阳,诸葛斌,方慧英,宗红,孙进,龚星慧,诸葛健,楼笑笑,冯倩. 微生物学通报. 2014(01)
硕士论文
[1]最适pH降低的中性蛋白酶Ⅰ基因在米曲霉中的表达[D]. 夏杨振兴.南昌大学 2016
[2]米曲霉中性蛋白酶基因在毕赤酵母中的重组表达及定向进化[D]. 雷达.南昌大学 2014
[3]米曲霉产中性蛋白酶高产菌株的选育及其发酵条件优化[D]. 袁艳玲.河南大学 2013
[4]营养型核桃多肽粉的研制[D]. 吴夏花.山西大学 2012
[5]高产中性蛋白酶菌株选育及产酶特性研究[D]. 陈鸿图.华南理工大学 2012
[6]豆瓣酱生产工艺优化研究[D]. 刘志伟.湖南农业大学 2012
[7]淀粉液化芽孢杆菌BS5582中性蛋白酶的研究[D]. 万岩松.江南大学 2012
[8]高产中性蛋白酶枯草杆菌的诱变选育、液体酶制备及酶学性质研究[D]. 陈文洁.兰州理工大学 2011
[9]芽孢杆菌N19中性蛋白酶发酵条件及其酶学性质研究[D]. 刘东旺.河北农业大学 2008
[10]中性蛋白酶高产菌株的诱变选育及发酵条件研究[D]. 马宏颖.河北农业大学 2008
本文编号：3116749
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
酪蛋白标准曲线
蛋白酶优势菌株分离、筛选和鉴产中性蛋白酶菌株的分离筛选的半成品，其发酵过程属于多菌株复合发红曲霉和酵母菌[83-86]等真菌，本试验使用中分离得到 18 株菌，通过中性蛋白酶培养初筛从中性蛋白酶培养基上挑选出透明圈 Y2。使用点植法将两株菌分别接入中性蛋别测定菌落直径和透明圈直径，结果见表水解情况。
图 4 硫酸铵分级沉淀上清液的水解情况hydrolysis of the supernatant precipitated by ammoniumarose Fast Flow 离子交换层析和聚乙二醇 20000 浓缩后的蛋白酶样品，利用换层析进一步纯化，洗脱图谱见图 5。褐色，经过硫酸铵盐析、透析除盐和浓缩后的素，先用 pH 值为 7.0 的 Tris-HCl 缓冲液对其和杂蛋白。从样品进入填料开始，观察到大约该峰出现在 NaCl 洗脱液洗脱之前，属于流出透明，大约从 60min 开始收集管内的收集液颜到褐色色素从上往下移动直至完全洗脱出来，吸收峰，此时 NaCl 溶液洗脱浓度达到 1.6mol脱浓度达到 2.0mol/mL时，峰 2 出峰完全，
【参考文献】：
期刊论文
[1]霉豆瓣中优势微生物蛋白酶活性测定[J]. 梅源,唐佳颖,何惠容,敖晓琳. 食品与发酵工业. 2017(09)
[2]豆瓣酱制曲工艺条件优化[J]. 刘云珍,许喜林,刘永琪,刘冬梅. 中国酿造. 2016(11)
[3]一种芽孢杆菌中性蛋白酶启动子的克隆和验证[J]. 纪明华,赵利超,史吉平,孙俊松. 食品工业科技. 2016(13)
[4]枯草芽孢杆菌JNB001蛋白酶特性的研究[J]. 余全法,吴劲松,竺礼斌,王海霞,曲道峰,韩剑众. 中国畜牧兽医. 2015(12)
[5]一种米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶解特性研究[J]. 宗红,冯颖杰,陆信曜,诸葛斌,方慧英,孙进,冯倩,楼笑笑,程英雀. 食品工业科技. 2015(20)
[6]解淀粉芽孢杆菌Z16的产酶条件优化及应用[J]. 曾诚,马毛毛,肖彦骏,曾哲灵,余平,钟卫民. 食品工业科技. 2016(03)
[7]一种米曲霉蛋白酶的酶学性质及其在酪蛋白磷酸肽制备中的应用[J]. 冯颖杰,宗红,诸葛斌,方慧英,陆信曜,孙进,冯倩,丁凤姣. 微生物学通报. 2015(11)
[8]米曲霉种曲制备工艺优化研究[J]. 赵中开,林艳,杨建刚,马莹莹,林秋,吴赫川. 中国酿造. 2014(08)
[9]1398中性蛋白酶的色谱柱纯化与分子鉴定[J]. 赵忠润,陈超,黄娇芳,俞峰,史吉平,孙俊松. 生物技术进展. 2014(03)
[10]米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究[J]. 马俊阳,诸葛斌,方慧英,宗红,孙进,龚星慧,诸葛健,楼笑笑,冯倩. 微生物学通报. 2014(01)
硕士论文
[1]最适pH降低的中性蛋白酶Ⅰ基因在米曲霉中的表达[D]. 夏杨振兴.南昌大学 2016
[2]米曲霉中性蛋白酶基因在毕赤酵母中的重组表达及定向进化[D]. 雷达.南昌大学 2014
[3]米曲霉产中性蛋白酶高产菌株的选育及其发酵条件优化[D]. 袁艳玲.河南大学 2013
[4]营养型核桃多肽粉的研制[D]. 吴夏花.山西大学 2012
[5]高产中性蛋白酶菌株选育及产酶特性研究[D]. 陈鸿图.华南理工大学 2012
[6]豆瓣酱生产工艺优化研究[D]. 刘志伟.湖南农业大学 2012
[7]淀粉液化芽孢杆菌BS5582中性蛋白酶的研究[D]. 万岩松.江南大学 2012
[8]高产中性蛋白酶枯草杆菌的诱变选育、液体酶制备及酶学性质研究[D]. 陈文洁.兰州理工大学 2011
[9]芽孢杆菌N19中性蛋白酶发酵条件及其酶学性质研究[D]. 刘东旺.河北农业大学 2008
[10]中性蛋白酶高产菌株的诱变选育及发酵条件研究[D]. 马宏颖.河北农业大学 2008
本文编号：3116749
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