乙醇酸氧化酶的分子改造及其在乙醛酸甲酯合成中的应用
发布时间：2021-04-05 15:11
乙醛酸甲酯是一种广泛应用于医药、化工等领域的重要中间体。乙醛酸甲酯可用于合成新型的治疗基因Ⅰ型的丙型肝炎感染药物雷迪帕韦,也可用于合成泛酸的前体—D-泛解酸内酯。化学法生产乙醛酸甲酯需要在高温、高压下进行而且容易过度氧化,生物法工艺条件温和,环境污染小,副产物少,具有重要的研究价值以及广阔的应用前景。乙醇酸氧化酶（Glycolate oxidase,GO,EC 1.1.3.15）催化乙醇酸甲酯氧化生成乙醛酸甲酯。天然酶的性质往往并不能满足生产的需求,对特定的底物催化活力低,而高活性的乙醇酸氧化酶是酶法生产乙醛酸甲酯的基础。本论文首先选取菠菜来源的乙醇酸氧化酶基因在大肠杆菌中重组表达,并运用蛋白质工程手段对该乙醇酸氧化酶进行分子改造,以提高其催化活力。其次,利用融合表达技术获得的多功能酶来促进可溶性表达,并进一步提升催化表现。将过氧化氢酶和血红蛋白与乙醇酸氧化酶进行融合,并对融合酶的连接肽进行优化,最终成功获得表达高催化活性融合酶的重组菌。最终,以表达高催化活性融合酶的重组菌为生物催化剂,构建酶法生产乙醛酸甲酯的反应体系并对其反应条件进行了优化。具体的内容包括:（1）通过易错PCR法对乙...
【文章来源】：浙江工业大学浙江省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
乙醛酸甲酯的结构式Figure1.1Thestructureofmethylglyoxylate
跫??蟾撸?芰肯?慕洗螅?曳?应过程中需要用到强氧化剂以及强酸，严重的污染环境。化学法生产过程中还会产生大量副产物，为后续的分离纯化也带来了极大的困难。因此，寻求绿色环保可持续发展的生产工艺是大势所趋[8]。（1）马来酸二甲酯臭氧氧化法TJDonohoe等将臭氧鼓泡通入含有马来酸二甲酯的CH2Cl2溶液中2h，然后再将剩余的蓝色溶液用氧气吹扫5min。在-78℃条件下向溶液中滴加二甲基硫醚，并将反应混合物温热至室温。减压除去溶剂，并将剩余的溶液通过真空蒸馏，最终得到得率为70%的无色油状物乙醛酸甲酯，其反应式如图1-2所示。此法反应速率快，污染少。缺点是反应过程中需要使用过量的臭氧，给规模化的工业生产带来较大的困难。图1-2马来酸二甲酯臭氧氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-2Preparationofmethylglyoxylatebyozoneoxidationofdimethylmaleate（2）酒石酸二甲酯高碘酸氧化法DHorne等在冰浴冷却的35％THF的乙醚溶液中迅速搅拌的酒石酸二甲酯溶液，加入的粉末状的H5IO6。在0℃下搅拌1小时后，将其加热并在25℃下搅拌直至TLC显色表明酒石酸二甲酯完全消耗。用乙醚稀释，过滤并用MgSO4和K2CO3干燥。最终将产物进行浓缩和蒸馏，得到得率为83％的澄清无色油状物乙醛酸甲酯，其反应式如图1-3所示。该法反应条件温和，速率快。缺点是通过强酸条件发生反应，极易造成设备腐蚀，对反应器有较高的要求，设备昂贵。图1-3酒石酸二甲酯高碘酸氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-3Preparationofmethylglyoxylatebyperiodateoxidationofdimethyltartrate（3）二甲氧基乙醛酸甲酯与乙醛酸一水化合物烷基交换法张志霞等介绍一种新型的乙醛酸甲酯合成工艺，通过二甲氧基乙醛酸甲酯与乙醛酸一水化合物的烷基化交换反应，获得反应混合物。具体方法如下向250mL?
过程中需要使用过量的臭氧，给规模化的工业生产带来较大的困难。图1-2马来酸二甲酯臭氧氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-2Preparationofmethylglyoxylatebyozoneoxidationofdimethylmaleate（2）酒石酸二甲酯高碘酸氧化法DHorne等在冰浴冷却的35％THF的乙醚溶液中迅速搅拌的酒石酸二甲酯溶液，加入的粉末状的H5IO6。在0℃下搅拌1小时后，将其加热并在25℃下搅拌直至TLC显色表明酒石酸二甲酯完全消耗。用乙醚稀释，过滤并用MgSO4和K2CO3干燥。最终将产物进行浓缩和蒸馏，得到得率为83％的澄清无色油状物乙醛酸甲酯，其反应式如图1-3所示。该法反应条件温和，速率快。缺点是通过强酸条件发生反应，极易造成设备腐蚀，对反应器有较高的要求，设备昂贵。图1-3酒石酸二甲酯高碘酸氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-3Preparationofmethylglyoxylatebyperiodateoxidationofdimethyltartrate（3）二甲氧基乙醛酸甲酯与乙醛酸一水化合物烷基交换法张志霞等介绍一种新型的乙醛酸甲酯合成工艺，通过二甲氧基乙醛酸甲酯与乙醛酸一水化合物的烷基化交换反应，获得反应混合物。具体方法如下向250mL三口瓶中加入乙醛酸一水合物9.2g(0.1mol)，二甲氧基乙醛酸甲酯13.4g(0.1mol)，一水合对甲苯磺酸0.2g，在80℃搅拌反应19h。在冰水浴条件下向获得
【参考文献】：
期刊论文
[1]融合蛋白接头的研究进展[J]. 毛芸,李红民. 功能材料. 2018(02)
[2]化学酶法合成D-泛解酸内酯的研究进展[J]. 汪钊,黄美娟,高亮,应向贤,赵嫚,孙杰. 发酵科技通讯. 2016(04)
[3]雷迪帕韦及其关键中间体的合成研究[J]. 赵聿秋,孙光祥. 上海医药. 2016(09)
[4]乙醛酸酯的合成工艺研究[J]. 张志霞,朱全,刘超,王晓燕. 河北师范大学学报(自然科学版). 2012(06)
[5]乙醛酸和草酸的高效液相色谱分析[J]. 刘树彬,陆敏,张星辰,张萍,牟微. 应用化工. 2007(10)
[6]透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究[J]. 王清路,张锐,倪万潮,陈毓荃,郭三堆. 生物工程学报. 2004(05)
[7]菠菜乙醇酸氧化酶基因的克隆及表达[J]. 晋剑锋,谭天伟,苏国富. 生物工程学报. 2002(02)
[8]透明颤菌血红蛋白及其基因的研究进展[J]. 于慧敏,沈忠耀. 微生物学报. 1999(05)
博士论文
[1]双功能β-葡聚糖酶—木聚糖酶与β-葡聚糖酶—植酸酶融合酶的优化构建及其酶学特性分析[D]. 陆平.浙江大学 2008
本文编号：3119861
【文章来源】：浙江工业大学浙江省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
乙醛酸甲酯的结构式Figure1.1Thestructureofmethylglyoxylate
跫??蟾撸?芰肯?慕洗螅?曳?应过程中需要用到强氧化剂以及强酸，严重的污染环境。化学法生产过程中还会产生大量副产物，为后续的分离纯化也带来了极大的困难。因此，寻求绿色环保可持续发展的生产工艺是大势所趋[8]。（1）马来酸二甲酯臭氧氧化法TJDonohoe等将臭氧鼓泡通入含有马来酸二甲酯的CH2Cl2溶液中2h，然后再将剩余的蓝色溶液用氧气吹扫5min。在-78℃条件下向溶液中滴加二甲基硫醚，并将反应混合物温热至室温。减压除去溶剂，并将剩余的溶液通过真空蒸馏，最终得到得率为70%的无色油状物乙醛酸甲酯，其反应式如图1-2所示。此法反应速率快，污染少。缺点是反应过程中需要使用过量的臭氧，给规模化的工业生产带来较大的困难。图1-2马来酸二甲酯臭氧氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-2Preparationofmethylglyoxylatebyozoneoxidationofdimethylmaleate（2）酒石酸二甲酯高碘酸氧化法DHorne等在冰浴冷却的35％THF的乙醚溶液中迅速搅拌的酒石酸二甲酯溶液，加入的粉末状的H5IO6。在0℃下搅拌1小时后，将其加热并在25℃下搅拌直至TLC显色表明酒石酸二甲酯完全消耗。用乙醚稀释，过滤并用MgSO4和K2CO3干燥。最终将产物进行浓缩和蒸馏，得到得率为83％的澄清无色油状物乙醛酸甲酯，其反应式如图1-3所示。该法反应条件温和，速率快。缺点是通过强酸条件发生反应，极易造成设备腐蚀，对反应器有较高的要求，设备昂贵。图1-3酒石酸二甲酯高碘酸氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-3Preparationofmethylglyoxylatebyperiodateoxidationofdimethyltartrate（3）二甲氧基乙醛酸甲酯与乙醛酸一水化合物烷基交换法张志霞等介绍一种新型的乙醛酸甲酯合成工艺，通过二甲氧基乙醛酸甲酯与乙醛酸一水化合物的烷基化交换反应，获得反应混合物。具体方法如下向250mL?
过程中需要使用过量的臭氧，给规模化的工业生产带来较大的困难。图1-2马来酸二甲酯臭氧氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-2Preparationofmethylglyoxylatebyozoneoxidationofdimethylmaleate（2）酒石酸二甲酯高碘酸氧化法DHorne等在冰浴冷却的35％THF的乙醚溶液中迅速搅拌的酒石酸二甲酯溶液，加入的粉末状的H5IO6。在0℃下搅拌1小时后，将其加热并在25℃下搅拌直至TLC显色表明酒石酸二甲酯完全消耗。用乙醚稀释，过滤并用MgSO4和K2CO3干燥。最终将产物进行浓缩和蒸馏，得到得率为83％的澄清无色油状物乙醛酸甲酯，其反应式如图1-3所示。该法反应条件温和，速率快。缺点是通过强酸条件发生反应，极易造成设备腐蚀，对反应器有较高的要求，设备昂贵。图1-3酒石酸二甲酯高碘酸氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-3Preparationofmethylglyoxylatebyperiodateoxidationofdimethyltartrate（3）二甲氧基乙醛酸甲酯与乙醛酸一水化合物烷基交换法张志霞等介绍一种新型的乙醛酸甲酯合成工艺，通过二甲氧基乙醛酸甲酯与乙醛酸一水化合物的烷基化交换反应，获得反应混合物。具体方法如下向250mL三口瓶中加入乙醛酸一水合物9.2g(0.1mol)，二甲氧基乙醛酸甲酯13.4g(0.1mol)，一水合对甲苯磺酸0.2g，在80℃搅拌反应19h。在冰水浴条件下向获得
【参考文献】：
期刊论文
[1]融合蛋白接头的研究进展[J]. 毛芸,李红民. 功能材料. 2018(02)
[2]化学酶法合成D-泛解酸内酯的研究进展[J]. 汪钊,黄美娟,高亮,应向贤,赵嫚,孙杰. 发酵科技通讯. 2016(04)
[3]雷迪帕韦及其关键中间体的合成研究[J]. 赵聿秋,孙光祥. 上海医药. 2016(09)
[4]乙醛酸酯的合成工艺研究[J]. 张志霞,朱全,刘超,王晓燕. 河北师范大学学报(自然科学版). 2012(06)
[5]乙醛酸和草酸的高效液相色谱分析[J]. 刘树彬,陆敏,张星辰,张萍,牟微. 应用化工. 2007(10)
[6]透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究[J]. 王清路,张锐,倪万潮,陈毓荃,郭三堆. 生物工程学报. 2004(05)
[7]菠菜乙醇酸氧化酶基因的克隆及表达[J]. 晋剑锋,谭天伟,苏国富. 生物工程学报. 2002(02)
[8]透明颤菌血红蛋白及其基因的研究进展[J]. 于慧敏,沈忠耀. 微生物学报. 1999(05)
博士论文
[1]双功能β-葡聚糖酶—木聚糖酶与β-葡聚糖酶—植酸酶融合酶的优化构建及其酶学特性分析[D]. 陆平.浙江大学 2008
本文编号：3119861
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3119861.html
最近更新
教材专著
