重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇转运通道强化、发酵及提取研究
发布时间：2021-04-22 10:30
1,2,4-丁三醇（1,2,4-butanetriol,BT）是一种平台化合物,其性质与甘油相似,广泛地应用于军工、医药和化妆品等领域,但BT不是天然的生物产物,生物合成研究也尚在起步阶段,前期研究我们利用合成生物学构建了产BT菌株并发现BT在胞内有积累可能影响其合成,同时,其发酵尚需完善且下游分离技术研究极少。因此,本研究通过异源表达耐药结节分化家族（resistance nodulation and cell division,RND）外排泵基因、优化5 L发酵罐中培养条件和探索BT的分离工艺,以期提高BT产量,探索工业上生物合成法生产BT的技术路线。为加强BT的外排从而促进BT的合成,研究利用来自克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的RND外排泵基因acrA、acrB、acrE、acrF、tolC、mexA、mexB、mexE、mexF、oprN、oprM和多基因组合的acrAB、acrEF、acrAB-tolC、acrEF-tolC、mexAB、mexEF、mexAB-oprM、mexEF-opr...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 1,2,4-丁三醇的研究现状
1.1.1 1,2,4-丁三醇特性及其应用
1.1.2 化学法合成BT
1.1.3 生物法生产BT
1.2 外排泵蛋白的研究进展
1.3 传统生物基产品的提取方法
1.4 双水相萃取技术及其应用
1.5 课题立题意义与研究内容
1.5.1 立题意义
1.5.2 主要研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 实验试剂与酶
2.1.3 主要仪器
2.1.4 培养基
2.2 方法
2.2.1 培养方法
2.2.2 生物量与代谢产物的检测方法
2.2.3 引物设计
2.2.4 细菌基因组的提取方法
2.2.5 目的基因片段的PCR扩增反应与纯化
2.2.6 表达载体的构建方法
2.2.7 E.coli感受态细胞制备
2.2.8 E.coli感受态细胞转化
2.2.9 胞内物质的测定
2.2.10 蛋白表达情况的测试
2.2.11 BT的双水相萃取方法
2.2.12 计算公式
第三章 结果与讨论
3.1 BT工程菌株外排通道强化
3.1.1 利用来自K.pneumoniae的RND蛋白对BT外排强化
3.1.2 利用来自P.aeruginosa的RND蛋白对BT外排强化
3.1.3 多基因强化对BT外排
3.1.4 外排泵蛋白基因的蛋白表达
3.2 强化BT外排蛋白菌株的发酵
3.2.1 强化BT外排泵蛋白菌株5L发酵罐分批发酵
3.2.2 补料方式对BT产量的影响
3.2.3 补料碳氮比对BT产量的影响
3.3 双水相技术分离发酵液中BT的初步探索
3.3.1 萃取分离BT双水相体系的筛选及体系相图的绘制
2HPO4质量分数对BT萃取效率的影响"> 3.3.2 双水相体系中无水乙醇/K2HPO4质量分数对BT萃取效率的影响
3.3.3 pH对BT萃取效率的影响
3.3.4 500g双水相体系萃取效果评价
主要结论与展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]近平滑假丝酵母ATCC7330中羰基还原酶双水相萃取工艺研究[J]. 王伟,刘云,余华顺,戴秋红,姚鹃,龚大春. 化学与生物工程. 2020(01)
[2]双水相萃取分离α-酮戊二酸[J]. 裴莹,孙玉波,黄斌. 食品与发酵工业. 2018(12)
[3]采用双水相萃取技术提取ε-聚赖氨酸[J]. 马玉,张龙,陈旭升,毛忠贵. 食品与发酵工业. 2018(08)
[4]微波辅助双水相萃取龙胆中黄酮化合物[J]. 朱丹,杨菁,李林龙,杨航,黎燕. 亚太传统医药. 2017(17)
[5]双水相萃取技术原理及其在天然产物分离中的应用[J]. 邓祥,韩伟. 机电信息. 2017(11)
[6]微生物同步利用葡萄糖和木糖代谢工程概述[J]. 李燕军,赵岩,黄龙辉,李娟,谢希贤,陈宁. 发酵科技通讯. 2017(01)
[7]工业微生物[J]. 工业微生物. 2016(04)
[8]小分子有机溶剂双水相在分离分析中应用研究进展[J]. 郭东刚,邵丽,杨旭,王庆伟. 化学世界. 2016(05)
[9]丙醇-硫酸铵-1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚双水相萃取铅（Ⅱ）[J]. 董红敏,沈亮亮,张树贵,陈腾,覃事栋. 光谱实验室. 2013(06)
[10]双水相体系中成相及有机物分配机理的初步研究[J]. 刘绍鹏,宗志敏,魏晴,魏贤勇. 化工时刊. 2010(12)
博士论文
[1]反应萃取法分离发酵液中2，3-丁二醇的研究[D]. 李琰君.华东理工大学 2012
[2]铜绿假单胞菌中RND外排泵基因表达调节和功能研究[D]. 杨亮.西北大学 2010
硕士论文
[1]整合型1,2,4-丁三醇合成菌株的构建及发酵条件优化[D]. 祖金珊.江南大学 2019
[2]多策略强化1,2,4-丁三醇的生物合成[D]. 景培源.江南大学 2018
[3]肺炎克雷伯氏菌重要膜蛋白基因的功能研究[D]. 俞百慧.北京化工大学 2017
[4]反应萃取法分离发酵液中1，2，4-丁三醇[D]. 李敏.中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所) 2017
[5]外排泵MexAB-OprM在铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制的研究[D]. 潘亚萍.安徽医科大学 2017
[6]重组大肠杆菌D-1,2,4-丁三醇合成中副产物途径的敲除及关键酶的强化表达[D]. 何姝颖.江南大学 2017
[7]重组大肠杆菌合成D-1,2,4-丁三醇代谢系统的理性改造[D]. 马鹏飞.北京理工大学 2015
[8]重组大肠杆菌中1,2,4-丁三醇合成途径的构建和优化[D]. 孙雷.江南大学 2015
[9]生物法合成D-1,2,4-丁三醇关键基因的克隆及重组菌的构建[D]. 孙文龙.江南大学 2014
[10]萃取分离提取发酵液中1，3-丙二醇[D]. 徐兴军.华东理工大学 2013
本文编号：3153621
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 1,2,4-丁三醇的研究现状
1.1.1 1,2,4-丁三醇特性及其应用
1.1.2 化学法合成BT
1.1.3 生物法生产BT
1.2 外排泵蛋白的研究进展
1.3 传统生物基产品的提取方法
1.4 双水相萃取技术及其应用
1.5 课题立题意义与研究内容
1.5.1 立题意义
1.5.2 主要研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 实验试剂与酶
2.1.3 主要仪器
2.1.4 培养基
2.2 方法
2.2.1 培养方法
2.2.2 生物量与代谢产物的检测方法
2.2.3 引物设计
2.2.4 细菌基因组的提取方法
2.2.5 目的基因片段的PCR扩增反应与纯化
2.2.6 表达载体的构建方法
2.2.7 E.coli感受态细胞制备
2.2.8 E.coli感受态细胞转化
2.2.9 胞内物质的测定
2.2.10 蛋白表达情况的测试
2.2.11 BT的双水相萃取方法
2.2.12 计算公式
第三章 结果与讨论
3.1 BT工程菌株外排通道强化
3.1.1 利用来自K.pneumoniae的RND蛋白对BT外排强化
3.1.2 利用来自P.aeruginosa的RND蛋白对BT外排强化
3.1.3 多基因强化对BT外排
3.1.4 外排泵蛋白基因的蛋白表达
3.2 强化BT外排蛋白菌株的发酵
3.2.1 强化BT外排泵蛋白菌株5L发酵罐分批发酵
3.2.2 补料方式对BT产量的影响
3.2.3 补料碳氮比对BT产量的影响
3.3 双水相技术分离发酵液中BT的初步探索
3.3.1 萃取分离BT双水相体系的筛选及体系相图的绘制
2HPO4质量分数对BT萃取效率的影响"> 3.3.2 双水相体系中无水乙醇/K2HPO4质量分数对BT萃取效率的影响
3.3.3 pH对BT萃取效率的影响
3.3.4 500g双水相体系萃取效果评价
主要结论与展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]近平滑假丝酵母ATCC7330中羰基还原酶双水相萃取工艺研究[J]. 王伟,刘云,余华顺,戴秋红,姚鹃,龚大春. 化学与生物工程. 2020(01)
[2]双水相萃取分离α-酮戊二酸[J]. 裴莹,孙玉波,黄斌. 食品与发酵工业. 2018(12)
[3]采用双水相萃取技术提取ε-聚赖氨酸[J]. 马玉,张龙,陈旭升,毛忠贵. 食品与发酵工业. 2018(08)
[4]微波辅助双水相萃取龙胆中黄酮化合物[J]. 朱丹,杨菁,李林龙,杨航,黎燕. 亚太传统医药. 2017(17)
[5]双水相萃取技术原理及其在天然产物分离中的应用[J]. 邓祥,韩伟. 机电信息. 2017(11)
[6]微生物同步利用葡萄糖和木糖代谢工程概述[J]. 李燕军,赵岩,黄龙辉,李娟,谢希贤,陈宁. 发酵科技通讯. 2017(01)
[7]工业微生物[J]. 工业微生物. 2016(04)
[8]小分子有机溶剂双水相在分离分析中应用研究进展[J]. 郭东刚,邵丽,杨旭,王庆伟. 化学世界. 2016(05)
[9]丙醇-硫酸铵-1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚双水相萃取铅（Ⅱ）[J]. 董红敏,沈亮亮,张树贵,陈腾,覃事栋. 光谱实验室. 2013(06)
[10]双水相体系中成相及有机物分配机理的初步研究[J]. 刘绍鹏,宗志敏,魏晴,魏贤勇. 化工时刊. 2010(12)
博士论文
[1]反应萃取法分离发酵液中2，3-丁二醇的研究[D]. 李琰君.华东理工大学 2012
[2]铜绿假单胞菌中RND外排泵基因表达调节和功能研究[D]. 杨亮.西北大学 2010
硕士论文
[1]整合型1,2,4-丁三醇合成菌株的构建及发酵条件优化[D]. 祖金珊.江南大学 2019
[2]多策略强化1,2,4-丁三醇的生物合成[D]. 景培源.江南大学 2018
[3]肺炎克雷伯氏菌重要膜蛋白基因的功能研究[D]. 俞百慧.北京化工大学 2017
[4]反应萃取法分离发酵液中1，2，4-丁三醇[D]. 李敏.中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所) 2017
[5]外排泵MexAB-OprM在铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制的研究[D]. 潘亚萍.安徽医科大学 2017
[6]重组大肠杆菌D-1,2,4-丁三醇合成中副产物途径的敲除及关键酶的强化表达[D]. 何姝颖.江南大学 2017
[7]重组大肠杆菌合成D-1,2,4-丁三醇代谢系统的理性改造[D]. 马鹏飞.北京理工大学 2015
[8]重组大肠杆菌中1,2,4-丁三醇合成途径的构建和优化[D]. 孙雷.江南大学 2015
[9]生物法合成D-1,2,4-丁三醇关键基因的克隆及重组菌的构建[D]. 孙文龙.江南大学 2014
[10]萃取分离提取发酵液中1，3-丙二醇[D]. 徐兴军.华东理工大学 2013
本文编号：3153621
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3153621.html
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