半乳糖氧化酶/超氧化物歧化酶双酶催化5-羟甲基糠醛的氧化的研究

发布时间：2021-04-26 19:45

　　5-羟甲基糠醛（HMF）作为一种可以生产多种化学品的原材料越来越受到人们的重视,但随着工业化的发展,在生产过程中的污染物的产生也成为了重大的难题。本文采取了一种绿色环保的方法来催化HMF,利用半乳糖氧化酶（GOase）对羟基的特异性识别来氧化HMF产生2,5-呋喃二甲醛（DFF）,并在整个催化过程中无任何污染物出现。GOase是一种可以催化多种底物的铜金属酶,在与空气接触的过程中会给予O2两个电子使其形成H2O2,而H2O2会对GOase造成不可逆的失活影响。因此本次研究同时引入锰超氧化物歧化酶（MnSOD）来减小H2O2的影响,MnSOD有着类似于过氧化物酶的性质,可以通过过还原反应给予H2O2一个电子,使其形成自由基来激发GOase的中心内部活性,或是分解了H2O2,从而降低H2O2对催化过程中的负面效果。此外也围绕这两种酶进行了复合物固定,通过加入Cu2+和PO43-使其与酶共同沉淀形成GOase/MnSOD-NF复合物。该复合物呈现出球状结构,表面上有着大量的裂纹间隙,直径是30 μm左右。通过激光共聚焦和X-射线光电子能谱（XPS）等仪器分析,表明了酶蛋白可以充分且均匀地分布... 

【文章来源】：北京化工大学北京市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
符号及缩略语说明
第一章 绪论
    1.1 5-羟甲基糠醛的转化
        1.1.1 5-羟甲基糠醛的来源及用途
        1.1.2 5-羟甲基糠醛的催化途径
    1.2 半乳糖氧化酶
        1.2.1 半乳糖氧化酶的简介及用途
        1.2.2 半乳糖氧化酶的催化机理
    1.3 超氧化物歧化酶
        1.3.1 超氧化物歧化酶的简介
        1.3.2 超氧化物歧化酶的来源及应用
    1.4 酶固定化
        1.4.1 酶固定化简介
        1.4.2 酶固定化方法
            1.4.2.1 吸附
            1.4.2.2 共价结合
            1.4.2.3 亲和固定
            1.4.2.4 包埋
        1.4.3 金属仿生结构
            1.4.3.1 金属仿生结构的介绍
            1.4.3.2 蛋白无机纳米花
            1.4.3.3 蛋白无机纳米花的形成机理
    1.5 课题意义及研究内容
第二章 MnSOD表达载体的构建
    2.1 引言
    2.2 实验材料与器材
        2.2.1 工程菌与载体
        2.2.2 引物的设计与序列
        2.2.3 实验试剂
            2.2.3.1 质粒回收试剂盒与限制性核酸内切酶
            2.2.3.2 溶液配方
            2.2.3.3 实验试剂
            2.2.3.4 实验器材
    2.3 pET-28a-MnSOD载体构建
        2.3.1 MnSOD基因片段的来源及合成
        2.3.2 质粒提取
        2.3.3 MnSOD基因片段扩增
        2.3.4 目的基因片段回收
            2.3.4.1 核酸电泳回收
            2.3.4.2 快速回收
        2.3.5 载体与目的片段酶切
        2.3.6 载体与目的片段连接
        2.3.7 转化
            2.3.7.1 感受态细胞的准备
            2.3.7.2 转化步骤
        2.3.8 阳性筛选
    2.4 结果与分析
        2.4.1 MnSOD基因片段扩增结果
        2.4.2 载体pET-28a与扩增片段的酶切结果
        2.4.3 阳性重组子鉴定结果
    2.5 本章小结
第三章 MnSOD的表达与纯化
    3.1 引言
    3.2 实验材料与相关试剂
        3.2.1 菌种与载体
        3.2.2 实验溶液配方
        3.2.3 主要试剂
        3.2.4 实验仪器
    3.3 MnSOD的表达与纯化
        3.3.1 MnSOD的预表达
        3.3.2 MnSOD的放大培养
        3.3.3 MnSOD的纯化
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 MnSOD的预表达
        3.4.2 MnSOD及其他蛋白的纯化
    3.5 本章小结
第四章 双酶复合物的构建与活性表征
    4.1 引言
    4.2 实验部分
        4.2.1 实验菌种与酶
        4.2.2 试剂与溶液配方
        4.2.3 实验仪器
        4.2.4 蛋白透析
        4.2.5 蛋白含量的计算
        4.2.6 标准曲线的计算
        4.2.7 GOase-NF、GOase/MnSOD-NF复合物的构建
        4.2.8 复合物结构的荧光染色
        4.2.9 固定效率计算
        4.2.10 蛋白含量对纳米花复合物结构的影响
        4.2.11 GOase-NF催化HMF的氧化
        4.2.12 GOase/MnSOD-NF对过氧化氢的耐受性
        4.2.13 仪器表征
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 GOase-NF与GOase/MnSOD-NF复合物构建及表征
        4.3.2 GOase-NF催化HMF的氧化
        4.3.3 GOase/MnSOD-NF的活性
        4.3.4 GOase/MnSOD-NF对过氧化氢的耐受性
        4.3.5 时间长度对GOase/MnSOD -NF的活性影响
    4.4 小结
第五章 结论
参考文献
致谢
作者及导师简介
附件


【参考文献】：
期刊论文
[1]人铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化[J]. 刘磊,许淑芬,方艳秋,谭岩.  中国老年学杂志. 2008(05)
[2]仙人掌超氧化物歧化酶的纯化及其部分性质研究[J]. 余旭亚,赵声兰,李涛,陈朝银.  精细化工. 2002(04)
[3]动物血液的开发利用[J]. 刁治民,杜军华,马寿福.  青海科技. 2000(03)
[4]桑叶超氧化物歧化酶的提纯和性质的研究[J]. 袁艺,李纯,张小青.  安徽农业大学学报. 1997(03)



本文编号：3162006