Lasiodiplodia iranensis发酵产茉莉酮酸的合成途径研究

发布时间：2021-04-28 11:53

　　茉莉酮酸是由脂肪酸衍生而来的环戊酮化合物,在农业、香精香料、医药行业具有广阔的应用前景。目前植物中茉莉酮酸的合成途径已较为清楚,但真菌中对茉莉酮酸合成的研究还局限于同位素示踪法以及相关前体/代谢物质的检测。本实验室前期筛选到发酵产茉莉酮酸的伊朗二孢菌（Lasiodiplodia iranensis）,为提高其生产茉莉酮酸的产量,本文以L.iranensis为研究对象,通过发酵产物的GC-MS分析、基因组的测序分析、合成途径关键酶的挖掘及其体外催化验证,初步确定10R-LOX（10R-lipoxygenase）是茉莉酮酸合成的关键酶;通过添加前体α-亚麻酸发酵,茉莉酮酸的产量可提高1倍以上。具体如下:（1）发酵液中茉莉酮酸类物质的检测。发酵液甲酯化后,利用GC-MS法检测,茉莉酮酸类物质的最大占比为80.26%,其中茉莉酮酸为主要成分,最大占比为78.05%,其次为二氢茉莉酮酸,最大占比为2.21%,顺式茉莉酮含量甚微,仅占0.17%。（2）L.iranensis基因组测序结果分析。利用Illumina HiSeq测序平台对L.iranensis进行de novo测序,得到了43.01 ... 

【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 茉莉酮酸概况
        1.1.1 茉莉酮酸简介
        1.1.2 茉莉酮酸的用途
        1.1.3 茉莉酮酸的合成
    1.2 Lasiodiplodia概况
        1.2.1 Lasiodiplodia theobromae
        1.2.2 茉莉酮酸发酵概况
        1.2.3 茉莉酮酸合成途径研究概况
        1.2.4 基因组研究概况
    1.3 论文的研究意义及研究内容
        1.3.1 研究意义
        1.3.2 研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌种
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 培养基
    2.2 实验方法
        2.2.1 培养方法
        2.2.2 发酵液的预处理
        2.2.3 GC-MS定量测定二氢茉莉酮酸方法性考察
        2.2.4 L.iranensis基因组DNA的提取与质检
        2.2.5 L.iranensis基因组文库的构建与质检
        2.2.6 L.iranensis基因组测序与数据分析
        2.2.7 候选基因的生物信息学分析
        2.2.8 逆转录PCR(RT-PCR)及荧光定量PCR(q RT-PCR)
        2.2.9 10R-LOX的表达及催化产物分析
        2.2.10 发酵过程中前体物质的添加
        2.2.11 重复批次发酵
    2.3 分析方法
        2.3.1 蔗糖浓度的测定
        2.3.2 HPLC测定茉莉酮酸产量
        2.3.3 GC-MS测定发酵液中茉莉酮酸类物质
        2.3.4 LC-MS测定10R-LOX催化产物
第三章 结果与讨论
    3.1 发酵液中茉莉酮酸类物质的检测分析
        3.1.1 GC-MS定性分析发酵液中相关成分
        3.1.2 GC-MS定量分析发酵液中二氢茉莉酮酸
    3.2 基因组测序结果分析
        3.2.1 基因组DNA的质检
        3.2.2 基因组文库的构建与质检
        3.2.3 基因组测序数据的评估
        3.2.4 基因组序列的拼接
        3.2.5 基因的预测与功能注释
        3.2.6 茉莉酮酸合成途径相关基因的挖掘
    3.3 茉莉酮酸合成相关候选基因的生物信息学分析
        3.3.1 10R-LOX生物信息学分析
        3.3.2 ACX生物信息学分析
        3.3.3 KAT生物信息学分析
    3.4 茉莉酮酸生物合成相关基因的验证
        3.4.1 RT-PCR验证
        3.4.2 q RT-PCR分析
    3.5 10R-LOX的克隆表达及催化产物分析
        3.5.1 重组质粒的构建
        3.5.2 重组10R-LOX的诱导表达
        3.5.3 重组10R-LOX催化反应产物的分析
        3.5.4 10R-LOX结构域保守基序的分析
    3.6 L.iranensis中茉莉酮酮酸的合成途径
    3.7 L.iranensis茉莉酮酸发酵试验
        3.7.1 蔗糖的补加对茉莉酮酸产量的影响
        3.7.2 亚麻酸的添加对茉莉酮酸产量的影响
        3.7.3 重复批次发酵对茉莉酮酸产量的影响
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录Ⅰ:作者攻读学术硕士期间发表的论文
附录Ⅱ:10R-LOX密码子优化后编码序列
附录Ⅲ:10R-LOX氨基酸序列


【参考文献】：
期刊论文
[1]手性香料的不对称催化合成研究进展[J]. 樊超,谢建华,周其林.  应用技术学报. 2018(03)
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[3]培养条件及杀菌剂对玉米穗腐病菌可可毛色二孢生长的影响[J]. 刘树森,胡清玉,杨扬,李坡,马红霞,石洁.  热带作物学报. 2018(08)
[4]不同浓度茉莉酸甲酯对春蜜桃果实品质的影响[J]. 李秋利,高登涛,魏志峰,王志强,刘军伟,杨文佳.  浙江农业学报. 2018(06)
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[6]一株毛色二孢菌发酵产茉莉酸[J]. 董文华,郑璞,陈鹏程,赵路平.  食品与发酵工业. 2018(03)
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[8]气相色谱质谱联用法分析藿香正气口服液中的挥发性成分[J]. 何志海,侯功坦,梁虹瑜,王珊,刘玉婷,周枝凤.  分析试验室. 2014(02)
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博士论文
[1]外源茉莉酸类化合物对两种落叶松的诱导抗虫性研究[D]. 孟昭军.东北林业大学 2008
[2]药用植物茉莉酸合成途径关键酶基因的克隆与研究[D]. 蒋科技.复旦大学 2007
[3]茉莉酸类对稻、高梁和果园草颖花开放的诱导效应[D]. 曾晓春.南京农业大学 2000

硕士论文
[1]Lasiodiplodia iranensis发酵产茉莉酸的研究[D]. 董文华.江南大学 2018
[2]芍药种子中α-亚麻酸生物合成相关基因的克隆与表达[D]. 姜瑶.扬州大学 2015
[3]龙眼焦腐病菌（Lasiodiplodia theobromae）转化体系的建立[D]. 叶金巧.福建农林大学 2009
[4]茉莉酸甲酯及其衍生物的合成和生物活性研究[D]. 邱华勇.中国农业大学 2004



本文编号：3165434