基于CRISPR/Cas9平台构建拟干酪乳杆菌高效生产L-乳酸生产菌株及其代谢分析研究

发布时间：2021-04-30 00:28

　　乳酸是自然界中应用最为广泛的天然有机酸,同时也是可降解高分子材料聚乳酸的前体物质。近年来,随着人们对生态环境的保护意识日益增强,极大地带动了聚乳酸行业的发展,进而扩大了市场对高质量乳酸的需求。拟干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）作为一株潜在的工业乳酸生产菌,前期研究表明其具有高效的L-乳酸生产能力,但生成的产物中仍含有少量D-乳酸,从而使L-乳酸的光学纯度达不到聚乳酸级别（>99.0%）。本研究通过建立拟干酪乳杆菌CRISPR/Cas9基因编辑平台,成功将高转录水平的ldhL1基因替换出发菌株中的ldhD基因,从而获得一株高效生产高质量L-乳酸的生产菌株,并对其在高糖浓度下发酵的生理代谢特性进行初步分析。首先,对拟干酪乳杆菌电转条件进行优化,确定了适用于拟干酪乳杆菌的最佳转化方法,使得转化效率可以达到104（CFU/μg DNA）以上。通过RT-PCR对拟干酪乳杆菌中存在的三个乳酸脱氢酶基因（ldhL1、ldhL2和ldhD）进行相对转录水平分析,确定以高转录水平的ldhL1基因为表型基因,构建CRISPR/Cas9基因编辑系统,从而实现拟干酪乳杆菌的高... 

【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 乳酸概述
        1.1.1 乳酸的性质及生产
        1.1.2 聚乳酸的应用
        1.1.3 乳酸的合成途径
    1.2 乳酸菌概述
        1.2.1 乳酸菌生理功能
        1.2.2 乳酸生产菌介绍
    1.3 乳酸菌遗传操作系统研究进展
        1.3.1 基于质粒的同源重组
        1.3.2 Red/RecET介导的DNA重组
    1.4 CRISPR技术的发展与应用
        1.4.1 CRISPR/Cas9系统作用原理
        1.4.2 CRISPR技术拓展应用
        1.4.3 Anti-CRISPRs蛋白的发现与应用
    1.5 微生物发酵动力学研究
    1.6 课题研究意义及内容
        1.6.1 研究意义
        1.6.2 研究内容
第2章 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 常用试剂
        2.1.4 常用培养基与试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 大肠杆菌DH5α和拟干酪乳杆菌的培养和保藏
        2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
        2.2.3 拟干酪乳杆菌感受态制备
        2.2.4 拟干酪乳杆菌抗性筛选标记的选择
        2.2.5 重组质粒的构建
        2.2.6 质粒DNA的提取
        2.2.7 DNA的胶回收
        2.2.8 PCR片段的纯化
        2.2.9 一步克隆连接
        2.2.10 拟干酪乳杆菌基因组DNA提取
        2.2.11 RNA反转录cDNA
        2.2.12 RT-PCR反应
        2.2.13 发酵液中L/D-乳酸检测
        2.2.14 菌体浓度测定
        2.2.15 发酵液残余葡萄糖检测
第3章 拟干酪乳杆菌CRISPR/Cas9基因编辑平台的建立
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验菌种
        3.2.2 实验质粒
        3.2.3 实验仪器
        3.2.4 实验引物
        3.2.5 ldhL1基因的sgRNA序列
        3.2.6 培养基
        3.2.7 L.paracasei电转条件的优化
        3.2.8 RT-PCR
    3.3 实验结果
        3.3.1 L.paracasei电转条件的优化
        3.3.2 拟干酪乳杆菌ldhL1、ldhL2和ldhD基因转录情况分析
        3.3.3 ldhL1基因敲除质粒构建
        3.3.4 ldhL1基因缺失突变株的获得及摇瓶发酵特性分析
    3.4 本章小结
第4章 高质量L-乳酸生产菌构建
    4.1 引言
    4.2 实验材料与方法
        4.2.1 实验菌种和质粒
        4.2.2 实验仪器与试剂
        4.2.3 培养基
        4.2.4 菌体的培养和保藏
        4.2.5 大肠杆菌DH5a感受态的制备及其热击转化
        4.2.6 拟干酪乳杆菌(L.paracasei NCBIO01)电击转化
        4.2.7 实验引物
        4.2.8 融合PCR
        4.2.9 DNA胶回收方法
        4.2.10 PCR片段纯化方法
        4.2.11 连接反应
        4.2.12 细菌基因组DNA的提取
        4.2.13 ldhD基因的sgRNA序列
    4.3 研究结果
        4.3.1 环境条件对拟干酪乳杆菌乳酸光学纯度的影响
        4.3.2 基于CRISPR/Cas9方法构建pNcas-ΔldhD-ldhL1重组质粒
        4.3.3 拟干酪乳杆菌D-乳酸脱氢酶缺失L-乳酸脱氢酶过表达重组菌获得
        4.3.4 ldhL1过表达突变株摇瓶发酵特性分析
    4.8 本章小结
第5章 高性能拟干酪乳杆菌发酵生产L-乳酸代谢特性分析
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 培养方法
        5.2.2 发酵副产物检测
        5.2.3 建模方法和数据处理
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 5L发酵罐中ldhL1过表达突变株与出发菌株生长和生产情况比较
        5.3.2 拟干酪乳杆菌发菌体生长和乳酸生成动力学模型建立
        5.3.3 高葡萄糖浓度下L-乳酸发酵代谢特性分析
    5.4 本章小结
第6章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
致谢
已发表或已录用的论文(专利)


【参考文献】：
期刊论文
[1]Anti-CRISPRs: The natural inhibitors for CRISPR-Cas systems[J]. Fei Zhang,Guoxu Song,Yong Tian.  Animal Models and Experimental Medicine. 2019(02)
[2]鼠李糖乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因ldhD的敲除[J]. 许黎明,成春燕,吕军.  基因组学与应用生物学. 2016(06)
[3]乳酸菌和少孢根霉菌发酵大豆加工休闲食品工艺优化[J]. 崔蕊静,刘素稳,康维民.  中国食品学报. 2015(09)
[4]高通量选育高速率产L-乳酸拟干酪乳杆菌[J]. 王光耀,刘慧兰,王永红,储炬,张嗣良.  食品工业. 2013(10)



本文编号：3168479