重组类球红细菌分别合成番茄红素和β-胡萝卜素

发布时间：2021-05-07 11:20

　　番茄红素和β-胡萝卜素是应用最广泛的两种类胡萝卜素。番茄红素是类胡萝卜素中最强的单线态氧猝灭剂,β-胡萝卜素是人体维生素A的重要前体。二者不但具有鲜艳的红、橙色泽,更重要的是其具有抗氧化和抗肿瘤等特性。因此,番茄红素和β-胡萝卜素被广泛应用于功能食品、医药保健和化妆品等领域,国际市场需求日益扩增。类球红细菌,属于光合细菌,是研究光合作用和膜蛋白的模式微生物。随着其遗传操作方法的成熟和代谢工程技术的发展,类球红细菌已成功用于多种高附加值化合物的生产。相比于传统的类胡萝卜素生产宿主,类球红细菌具有许多天然的优势。首先,类球红细菌本身含有类胡萝卜素合成基因簇,内含七个类胡萝卜素合成基因,能天然积累多种类胡萝卜素。其次,类球红细菌具有丰富的内膜系统,这非常有利于类胡萝卜素在膜上的大量积累。此外,类球红细菌可以在厌氧条件下合成类胡萝卜素,这对于微生物发酵来说非常关键,因为厌氧可以实现低碳损,降低生产成本。因此,本研究拟采用类球红细菌作为底盘细胞工厂,通过代谢工程改造,实现类球红细菌生物合成番茄红素和β-胡萝卜素。主要研究内容和结果如下:（1）在类球红细菌中构建番茄红素合成途径。我们选用深红红螺菌... 

【文章来源】：陕西师范大学陕西省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：96 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
中英文缩略词对照表
第1章 绪论
    1.1 番茄红素和β-胡萝卜素简介
        1.1.1 番茄红素的理化性质、生理功能及应用
        1.1.2 β-胡萝卜素的理化性质、生理功能及应用
    1.2 番茄红素和β-胡萝卜素的生产方法及现状
        1.2.1 植物提取
        1.2.2 化学合成
        1.2.3 微生物发酵
    1.3 微生物合成番茄红素和β-胡萝卜素的研究进展
        1.3.1 天然合成类胡萝卜素的微生物的研究进展
        1.3.2 异源合成类胡萝卜素的工程菌株的研究进展
    1.4 代谢工程的研究进展
        1.4.1 调节中心代谢途径
        1.4.2 提高MEP途径的代谢通量
    1.5 类球红细菌
        1.5.1 类球红细菌的研究及其应用
        1.5.2 类球红细菌的接合转移及其原理
    1.6 本课题的研究目的、意义和内容
        1.6.1 本课题的研究目的、意义
        1.6.2 研究内容
第2章 类球红细菌中番茄红素生物合成途径的构建
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 菌种、质粒和引物
        2.2.2 分子实验所用的试剂盒和酶类
        2.2.3 主要实验化学试剂
        2.2.4 培养基及抗生素
        2.2.5 主要实验仪器和设备
    2.3 实验内容和方法
        2.3.1 类球红细菌和深红红螺菌的培养及其基因组的提取
        2.3.2 大肠杆菌的培养及质粒的提取
        2.3.3 细菌生长检测及保存
        2.3.4 目的DNA片段的PCR扩增
        2.3.5 琼脂糖凝胶电泳及DNA回收
        2.3.6 质粒的酶切与连接
        2.3.7 大肠杆菌DH5a和S17-1感受态的制备及其热激转化
        2.3.8 双亲接合转移方法及其优化实验
        2.3.9 类球红细菌及其工程菌株的发酵培养
        2.3.10 类球红细菌及其工程菌株类胡萝卜素的提取与分析
    2.4 结果与分析
        2.4.1 双亲接合转移最优条件的选择
        2.4.2 八氢番茄红素四步脱氢酶CrtI_4的选择
        2.4.3 替换质粒pK18-△crtI_3::crtI_4的构建
        2.4.4 深红红螺菌的crtI_4基因替换类球红细菌自身的crtI_3基因
        2.4.5 敲除质粒pK18-△crtC的构建
        2.4.6 番茄红素工程菌株RL1的筛选及鉴定
        2.4.7 番茄红素工程菌株RL1发酵液中番茄红素的定量分析
    2.5 本章小结
第3章 敲除中心代谢途径关键基因zwf和整合表达MEP途径限速基因dxs提高番茄红素的产量
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 菌种、质粒和引物
        3.2.2 分子实验所用的试剂盒和酶类
    3.3 实验内容和方法
    3.4 实验结果与分析
        3.4.1 敲除质粒pK18-△zwf质粒的构建
        3.4.2 番茄红素工程菌株RL2的筛选及鉴定
        3.4.3 替换质粒pK18-△zwf::dxs的构建
        3.4.4 番茄红素工程菌株RL3的筛选及鉴定
        3.4.5 敲除zwf与整合表达dxs分别对番茄红素合成的影响
    3.5 本章小结
第4章 番茄红素工程菌株代谢机制及其发酵产物的定性
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 菌种、质粒和引物
        4.2.2 分子实验所用的试剂盒和酶类
        4.2.3 主要实验化学试剂
        4.2.4 主要仪器和设备
    4.3 实验内容和方法
        4.3.1 类球红细菌总RNA的提取
        4.3.2 实时荧光定量PCR
        4.3.3 培养基中葡萄糖含量的检测
        4.3.4 番茄红素的纯化结晶方法
        4.3.5 红外光谱检测方法
        4.3.6 核磁共振检测方法
    4.4 结果与分析
        4.4.1 番茄红素工程菌株相关基因转录水平对番茄红素含量的影响
        4.4.2 番茄红素工程菌株RL3的发酵过程分析
        4.4.3 番茄红素的分离纯化
        4.4.4 红外光谱测定结果
        4.4.5 核磁共振测定结果
    4.5 本章小结
第5章 类球红细菌中β-胡萝卜素生物合成途径的初步构建
    5.1 引言
    5.2 实验材料
        5.2.1 菌种、质粒和引物
        5.2.2 培养基及抗生素
    5.3 实验内容和方法
        5.3.1 成团泛菌的培养及其基因组DNA的提取
        5.3.2 β-胡萝卜素的定量分析
    5.4 结果与分析
        5.4.1 替换质粒pK18-△crtI_3::crtY~(pa)I~(pa)的构建
        5.4.2 利用成团泛菌来源的crtI~(pa)Y~(pa)分别在RL1和RL3中构建β-胡萝卜素生物合成途径
        5.4.3 β-胡萝卜素工程菌株的HPLC定量分析
    5.5 本章小结
第6章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间研究成果


【参考文献】：
期刊论文
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[6]代谢工程:一项不断发展的菌株改造技术[J]. 李寅.  生物工程学报. 2009(09)
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[9]番茄红素——具有保健功能的天然色素[J]. 吕春雷,皮士卿,刘云凤.  中国食品添加剂. 2005(03)
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博士论文
[1]番茄红素高产菌株三孢布拉霉的选育及其发酵和提取工艺研究[D]. 王强.江南大学 2015
[2]类球红细菌中辅酶Q10的代谢工程研究及应用[D]. 陆文强.浙江大学 2014
[3]大肠杆菌萜类异源合成系统的设计与构建[D]. 汪建峰.华东理工大学 2014
[4]大肠杆菌系统改造及琥珀酸和5-氨基乙酰丙酸合成途径的构建[D]. 康振.山东大学 2011

硕士论文
[1]危害核桃的成团泛菌及其系统进化分析[D]. 赵耘霄.山东农业大学 2016
[2]pucC超表达对Rhodobacter sphaeroides光合细菌表达体系异源蛋白表达水平的影响[D]. 程丽静.重庆大学 2012



本文编号：3173302