蟾酥炎性疼痛抑制因子的鉴定、活性及作用机制

发布时间：2021-05-08 18:13

　　炎性疼痛是由于各种刺激因素引起肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和神经末梢等释放炎症因子,引起局部组织炎症反应。当前治疗炎性疼痛的药物常常因出现耐药性和副作用而大大影响使用效果。据以往研究表明,作为两栖动物的中华大蟾蜍,其皮肤分泌物—蟾酥中含有多种活性物质,具有抗炎、镇痛、抗癌等多种药理活性。但其中关乎该抗炎镇痛功能的具体因子鲜为人知,因此开展本研究。本研究以中华大蟾蜍为研究对象,首先对蟾蜍的皮肤腺体（耳后腺）进行透射电镜（TEM）及扫描电镜（SEM）的观察,获取其腺体内部的超微结构,并推测其分泌方式为全浆分泌;之后用腺体转录组测序和分泌蛋白蛋白组测序和功能注释的方法对蟾酥多肽的主要功能进行了预测,鉴定出炎性疼痛抑制因子—神经肽B（Bg-NPB）。为了验证该功能预测的可靠性,本研究对蟾酥中鉴定的肿瘤细胞抑制活性进行了检测,结果显示蟾酥水提物可以有效地抑制癌细胞的增殖;同时检测了蟾酥水提物对血管生成的影响,发现其以剂量依赖性地抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖,并且通过抑制VEGF165-VEGFR2-RAS信号通路发挥抗血管生成作用,进一步达到肿瘤抑制的作用。因此上述结果验证了包括镇... 

【文章来源】：浙江农林大学浙江省

【文章页数】：99 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 文献综述
    1.1 两栖动物皮肤分泌物的研究进展
    1.2 蟾酥分泌的器官及方式
    1.3 蟾酥多肽的主要成分
    1.4 蟾酥多肽的药理活性活性
        1.4.1 抗菌活性
        1.4.2 抗肿瘤活性
        1.4.3 抑制血管生成活性
        1.4.4 其它活性
    1.5 目的及意义
    1.6 科学问题提出
2 蟾酥分泌腺体(耳后腺)的形态特征
    2.1 试验材料和仪器
        2.1.1 试验材料
            2.1.1.1 试验动物
            2.1.1.2 试验药品
        2.1.2 设备及耗材
    2.2 试验方法
        2.2.1 试剂配制
        2.2.2 耳后腺的超微结构观察
            2.2.2.1 扫描电镜的观察
            2.2.2.2 透射电镜的观察
    2.3 结果与分析
        2.3.1 耳后腺扫描电镜结果
        2.3.2 耳后腺透射电镜结果
    2.4 小结与讨论
3 基于大数据分析的蟾酥功能预测及验证
    3.1 试验材料和仪器
        3.1.1 试验材料
            3.1.1.1 试验动物及细胞
            3.1.1.2 试验药品
        3.1.2 设备及耗材
    3.2 试验方法
        3.2.1 耳后腺转录组测序
            3.2.1.1 提取样品总RNA
            3.2.1.2 测序质量数据评估
            3.2.1.3 测序碱基质量分析
            3.2.1.4 碱基分布检查
            3.2.1.5 测序数据质量预处理
            3.2.1.6 READS污染检测
            3.2.1.7 DE NOVO拼接
            3.2.1.8 UNIGENE注释
            3.2.1.9 UNIGENE表达丰度
            3.2.1.10 SSR分析
        3.2.2 蟾酥水提物的肿瘤细胞抑制活性
            3.2.2.1 细胞培养
            3.2.2.2 蟾酥水提物的制备
            3.2.2.3 蟾酥水提物的HPLC分析
            3.2.2.4 蟾酥水提物的肿瘤细胞抑制活性检测
            3.2.2.5 蟾酥水提物中的蛋白分析
        3.2.3 新鲜蟾酥(FTV)水提物对血管生成的影响
        3.2.4 统计分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 耳后腺转录组测序
            3.3.1.1 READS污染检测
            3.3.1.2 DE NOVO拼接
            3.3.1.3 UNIGENE注释
        3.3.2 生物学信息分析蟾酥多肽主要功能
        3.3.3 蟾酥水提物的肿瘤细胞抑制活性检测
        3.3.4 新鲜蟾酥(FTV)水提物对血管生成的影响
    3.4 小结与讨论
4 炎性疼痛抑制因子(Bg-NPB)的基因克隆和重组表达
    4.1 试验材料和仪器
        4.1.1 试验材料
            4.1.1.1 试验动物
            4.1.1.2 试验药品
        4.1.2 设备及耗材
    4.2 试验方法
        4.2.1 主要试剂配制
        4.2.2 Bg-NPB的基因克隆
        4.2.3 Bg-NPB基因的重组
        4.2.4 Bg-NPB基因的诱导表达
        4.2.5 Bg-NPB多肽的纯化
        4.2.6 SDS-PAGE电泳
    4.3 结果与分析
        4.3.1 Bg-NPB的 c DNA序列分析
        4.3.2 Bg-NPB-p ET-32a表达质粒的构建
        4.3.3 Bg-NPB融合基因的表达
    4.4 小结与讨论
5 Bg-NPB多肽的炎性疼痛抑制活性
    5.1 小鼠扭体法检测Bg-NPB多肽活性
        5.1.1 试验材料和仪器
            5.1.1.1 试验材料
            5.1.1.2 设备及耗材
        5.1.2 试验方法
            5.1.2.1 主要试剂配制
            5.1.2.2 小鼠镇痛实验
        5.1.3 统计分析
    5.2 大鼠舔足法检测Bg-NPB多肽活性
        5.2.1 试验材料和仪器
            5.2.1.1 试验材料
            5.2.1.2 设备及耗材
        5.2.2 试验方法
            5.2.2.1 主要试剂配制
            5.2.2.2 动物的处理
        5.2.3 统计分析
    5.3 Bg-NPB多肽对痛觉离子通道的影响
        5.3.1 试验材料和仪器
            5.3.1.1 试验材料
            5.3.1.2 设备及耗材
        5.3.2 试验方法
            5.3.2.1 主要试剂的配制
            5.3.2.2 细胞培养
            5.3.2.3 细胞转染
            5.3.2.4 爬片准备
            5.3.2.5 膜片钳试验
        5.3.3 统计分析
    5.4 结果与分析
        5.4.1 小鼠扭体法检测Bg-NPB多肽活性
            5.4.1.1 扭体潜伏时间
            5.4.1.2 扭体次数
        5.4.2 大鼠舔足法检测Bg-NPB多肽活性
            5.4.2.1 舔足潜伏时间
            5.4.2.2 15min内舔足次数
            5.4.2.3 30min内舔足次数
        5.4.3 Bg-NPB多肽对痛觉离子通道的影响
    5.5 小结与讨论
6 Bg-NPB抑制炎性疼痛的分子机制
    6.1 试验材料和仪器
        6.1.1 试验材料
            6.1.1.1 试验动物
            6.1.1.2 试验药品
        6.1.2 设备及耗材
    6.2 试验方法
        6.2.1 主要试剂配制
        6.2.2 酵母双杂交钓取Bg-NPB受体蛋白
            6.2.2.1 Bg-NPB-p GBKT7 重组质粒的构建
        6.2.3 痛觉信号通路
            6.2.3.1 动物组织的蛋白提取
            6.2.3.2 蛋白含量的测定(BCA法)
        6.2.4 统计分析
    6.3 结果与分析
        6.3.1 Bg-NPB-p GBKT7 重组质粒的构建
        6.3.2 痛觉蛋白含量的测定
    6.4 小结与讨论
7 讨论与结论
8 展望
参考文献
个人简介
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]利用UPLC-TQ-MS比较蟾酥鲜品和蟾酥商品化学成分[J]. 王子月,王洪兰,周婧,马宏跃,龚艳,闫文丽,钱大玮.  中国中药杂志. 2015(20)
[2]蟾酥活性成分抗肿瘤作用及其机制研究进展[J]. 董俊,翟笑枫.  中国生化药物杂志. 2015(04)
[3]蟾毒灵诱导骨肉瘤细胞株凋亡的蛋白质组学研究[J]. 谢显彪,温丽丽,尹军强,廖鸿益,邹昌业,王博,黄纲,沈靖南.  中国中药杂志. 2014(14)
[4]抗菌肽magainin20Ⅱ的密码子优化及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达[J]. 陈玉海,陈庆煌,陈科,章亭洲,陈吉龙.  生物工程学报. 2014(04)
[5]中华大蟾蜍耳后腺全长cDNA文库的构建[J]. 陈曦,周艳菊,夏明钰,刘东春,崔征,王东.  沈阳药科大学学报. 2012(12)
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[7]冬虫夏草与其非正品——戴氏虫草的生药学鉴别研究[J]. 康帅,罗晖明,郑健,林瑞超.  药物分析杂志. 2011(06)
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[10]蟾蜍灵对人非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响[J]. 朱志图,郁云龙,王锴,李恩泽,刘阳阳,刘云鹏.  中国肺癌杂志. 2010(09)

博士论文
[1]强心苷类似物抗肿瘤活性的构效关系研究及TORC2入核抑制剂的发现及构效关系研究[D]. 陈虎.华东理工大学 2016



本文编号：3175773