Corynebacterium sp.氮代谢PⅡ信号蛋白GlnK在L-精氨酸合成中的调控机制

发布时间：2021-05-12 09:29

　　L-精氨酸作为一种重要的工业氨基酸,广泛应用于医药、食品及动物饲料等领域。作为天然氨基酸中N:C比例最高的氨基酸,其合成与氮源吸收及利用密切相关。本研究以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）和高产L-精氨酸的钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）作为出发菌株,研究氮代谢PⅡ信号转导蛋白GlnK在氮调控及L-精氨酸合成中的作用,通过蛋白互作挖掘GlnK在L-精氨酸合成中的调控靶点,探究GlnK与其靶蛋白结合的生理意义,结合分子模拟及定点突变鉴定复合体的关键结合位点,最终解析清楚GlnK在L-精氨酸合成中的调控机制。主要研究内容如下:（1）比较蛋白质组学分析高低氮源浓度对钝齿棒杆菌胞内蛋白表达水平及代谢进程的影响发现,在低氮条件下,氮代谢相关蛋白的表达水平显著上调,其中GlnK表达量上调4.11倍;并且受氮源浓度影响表达差异显著蛋白主要集中在氨基酸代谢途径,表明氮调控相关蛋白与氨基酸合成可能存在联系,尤其是氮代谢信号蛋白GlnK。（2）构建glnK过表达、敲除及弱化菌株,探究GlnK对钝齿棒杆菌氮代谢及L-精氨酸合成的影响。结果发现,... 

【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 L-精氨酸的概述
        1.1.1 L-精氨酸的结构及理化性质
        1.1.2 L-精氨酸的生理功能及生产方法
        1.1.3 棒杆菌中L-精氨酸的合成途径
    1.2 棒杆菌中氮代谢调控与L-精氨酸合成的关系
    1.3 PⅡ信号转导蛋白的研究进展
        1.3.1 PⅡ蛋白超家族的特性分析
        1.3.2 PⅡ蛋白在氮代谢中的信号转导机制
    1.4 论文立题依据与研究意义
    1.5 论文研究思路与主要内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌种与质粒
        2.1.2 引物
    2.2 实验试剂和仪器
        2.2.1 主要实验试剂
        2.2.2 相关试剂的配制
        2.2.3 实验仪器
    2.3 培养基及培养条件
    2.4 实验方法
        2.4.1 染色体基因组DNA的提取与质粒DNA的提取
        2.4.2 大肠杆菌感受态与棒杆菌电转感受态细胞的制备
        2.4.3 重组大肠杆菌及棒杆菌的构建
        2.4.4 重组菌目的蛋白的过表达及纯化
        2.4.5 同源重组敲除技术
        2.4.6 比较蛋白质组学分析
        2.4.7 突变质粒的构建
        2.4.8 RNA的抽提和RT-q PCR
        2.4.9 重组钝齿棒杆菌的酶活检测
        2.4.10 蛋白互作GST pull-down实验分析
        2.4.11 Western Blot分析
        2.4.12 等温滴定量热法(ITC)测定蛋白与底物的结合
        2.4.13 L-精氨酸的反馈抑制实验
        2.4.14 蛋白质三维结构模拟及多序列比对
        2.4.15 分子对接与分子动力学模拟分析方法
        2.4.16 离子色谱检测NH4+的浓度
        2.4.17 整合突变
        2.4.18 氨基酸测定方法
        2.4.19 L-精氨酸的检测
第三章 结果与讨论
    3.1 比较蛋白质组学分析不同氮源浓度下钝齿棒杆菌中差异显著蛋白
        3.1.1 氮代谢相关蛋白及L-精氨酸合成相关蛋白的表达水平分析
        3.1.2 差异蛋白的功能富集
    3.2 钝齿棒杆菌中PⅡ信号转导蛋白Gln K对 L-精氨酸合成的影响
        3.2.1 过表达GlnK菌株的构建
        3.2.2 GlnK缺失菌株的构建
        3.2.3 CRISPRi系统的构建及弱化Gln K菌株的构建
        3.2.4 Gln K对 NH4+吸收的影响
        3.2.5 GlnK对氮代谢及L-精氨酸合成相关基因转录水平的影响
        3.2.6 GlnK对氮代谢及L-精氨酸合成关键酶酶活的影响
        3.2.7 GlnK对各种氨基酸合成的影响
        3.2.8 Cc-gln K,Cc-?gln K及 Cc-kd/gln K产 L-精氨酸性能比较
    3.3 钝齿棒杆菌中PⅡ信号转导蛋白Gln K调控靶点的鉴定
        3.3.1 GlnK同源序列比对
        3.3.2 ITC验证Gln K蛋白与其效应分子ATP及 ADP的结合
        3.3.3 钝齿棒杆菌全细胞范围内GlnK蛋白调控靶点的鉴定
        3.3.4 GST pull-down验证Gln K蛋白与氮转录调控因子Amt R的结合
        3.3.5 GST pull-down验证Gln K蛋白与N-乙酰谷氨酸激酶的结合
    3.4 谷氨酸棒杆菌中Gln K-NAGK互作生理意义探究及结合方式鉴定
        3.4.1 Gln K蛋白缓解NAGK受 L-精氨酸反馈抑制程度的测定
        3.4.2 Gln K与 NAGK蛋白分子对接及分析
        3.4.3 Gln K与 NAGK复合体分子动力学分析
    3.5 谷氨酸棒杆菌中Gln K-NAGK复合体关键结合位点的解析
        3.5.1 NAGK同源序列比对
        3.5.2 Gln K与 NAGK关键突变位点的选择
        3.5.3 Gln K与 NAGK突变株的构建及表达纯化
        3.5.4 突变后Gln K与 NAGK结合情况的测定
        3.5.5 Gln K及 NAGK突变体对NAGK反馈抑制作用的影响
        3.5.6 分子动力学分析Gln K突变体对Gln K-NAGK复合体的影响
        3.5.7 整合突变改造GlnK蛋白对L-精氨酸产量的影响
主要结论和展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD在谷氨酸棒杆菌JNR中的功能[J]. 李静,徐美娟,舒群峰,赵雅雯,唐蜜,张显,杨套伟,许正宏,饶志明.  微生物学报. 2019(11)
[2]L-精氨酸的理化性质、生理功能及生产工艺研究进展[J]. 王哲,周岩民.  饲料研究. 2014(13)
[3]钝齿棒杆菌N-乙酰鸟氨酸转氨酶的克隆表达分析及其重组菌的精氨酸发酵[J]. 徐美娟,张显,饶志明,杨娟,窦文芳,金坚,许正宏.  生物工程学报. 2011(07)
[4]高产精氨酸的钝齿棒杆菌在高低供氧条件下的差异蛋白质组学初步研究[J]. 陶帅,窦文芳,张晓梅,许泓瑜,饶志明,许正宏.  化工学报. 2011(06)
[5]L-精氨酸发酵研究进展[J]. 王霞,陶文沂,孙志浩,许正宏.  工业微生物. 2000(04)

博士论文
[1]钝齿棒杆菌SYPA5-5发酵产L-精氨酸的代谢工程改造[D]. 徐美娟.江南大学 2012

硕士论文
[1]钝齿棒杆菌SYPH5-8合成L-精氨酸的代谢工程改造[D]. 赵芹芹.江南大学 2014



本文编号：3183174