外源漆酶基因在里氏木霉中的表达及其应用基础研究

发布时间：2021-05-17 21:07

　　由血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus）产生的漆酶耐热性能良好,具有重要工业应用价值,但该菌所产漆酶活力较低,不适于规模化生产。本文采用基因重组技术,使外源漆酶基因在里氏木霉（Trichoderma reesei）中高效表达,并对重组里氏木霉的产酶性能及其在秸秆、有机污染物降解方面的应用进行了研究,主要结果如下:根据里氏木霉的密码子偏好性对来自血红密孔菌的漆酶基因进行了优化,并将其与里氏木霉强启动子Pcbh1、终止子Tcbh1和潮霉素抗性基因连接得到重组质粒pCH-1ac;再通过农杆菌介导技术,将此质粒转化到里氏木霉细胞中。对影响农杆菌介导转化效率的主要因素进行了研究,发现在共培养温度24 ℃,共培养基pH5.2,里氏木霉孢子浓度为107个/mL,共培养周期为60h条件下,介导转化效率最高。通过潮霉素抗性筛选及复筛得到9个重组转化子。对重组里氏木霉染色体DNA进行聚合酶链式反应（PCR）验证,表明外源漆酶基因已成功整合到里氏木霉的基因组上并可以稳定遗传。对转化子发酵液进行的SDS-PAGE蛋白电泳结果显示:在大约66kDa处有一个明显的条带,与血红密孔菌所产漆酶的条带... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：121 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
致谢
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 绪论
    1.1 引言
    1.2 漆酶概述
        1.2.1 漆酶来源
        1.2.2 漆酶的结构和反应机理
            1.2.2.1 漆酶的结构
            1.2.2.2 漆酶的反应机理
        1.2.3 漆酶的应用
            1.2.3.1 染料脱色
            1.2.3.2 农药降解
            1.2.3.3 木质素降解和纸浆漂白
            1.2.3.4 食品加工
            1.2.3.5 制药行业
        1.2.4 漆酶的介体
        1.2.5 漆酶的异源表达
            1.2.5.1 细菌表达系统
            1.2.5.2 酵母表达系统
            1.2.5.3 丝状真菌表达系统
            1.2.5.4 植物表达系统
    1.3 里氏木霉表达系统
        1.3.1 里氏木霉生产的酶
        1.3.2 里氏木霉启动子Pcbh1
        1.3.3 基因转化方法
            1.3.3.1 原生质体法
            1.3.3.2 基因枪法
            1.3.3.3 农杆菌介导法
        1.3.4 里氏木霉转化系统常用的筛选标记
        1.3.5 蛋白质糖基化
        1.3.6 里氏木霉对生物质原料的利用
    1.4 本课题的研究思路和拟研究内容
        1.4.1 本文主要研究内容
第二章 外源漆酶基因在里氏木霉中的克隆与表达
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 菌株和质粒
        2.2.2 试剂
            2.2.2.1 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液
            2.2.2.2 ABTS溶液
        2.2.3 实验仪器
        2.2.4 培养基
            2.2.4.1 大肠杆菌和农杆菌培养基
            2.2.4.2 里氏木霉培养基
        2.2.5 漆酶基因的优化
        2.2.6 转化质粒的构建
        2.2.7 质粒转入大肠杆菌
        2.2.8 质粒转入里氏木霉
        2.2.9 里氏木霉转化子的筛选
        2.2.10 里氏木霉转化子的产酶实验
        2.2.11 里氏木霉转化子基因组DNA的PCR检测
        2.2.12 测定方法
            2.2.12.1 漆酶活力的测定
            2.2.12.2 不同因素对农杆菌介导转化效率的影响
            2.2.12.3 发酵上清液的SDS-PAGE蛋白电泳检测
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 血红密孔菌漆酶基因的优化
        2.3.2 重组质粒pCH-lac的验证
        2.3.3 影响农杆菌介导转化效率因素的研究
            2.3.3.1 共培养温度对转化效率的影响
            2.3.3.2 培养基pH对转化效率的影响
            2.3.3.3 AS浓度对转化效率的影响
            2.3.3.4 里氏木霉孢子浓度对转化效率的影响
            2.3.3.5 共培养时间对转化效率的影响
        2.3.4 里氏木霉转化子的筛选
        2.3.5 里氏木霉转化子基因组的PCR验证
        2.3.6 转化子的产酶结果
        2.3.7 酶液的SDS-PAGE蛋白电泳分析
    2.4 本章小结
第三章 重组里氏木霉产漆酶及其酶学性质研究
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 菌株
        3.2.2 试剂
            3.2.2.1 DNS溶液
        3.2.3 实验仪器及设备
        3.2.4 培养基
        3.2.5 产酶实验
        3.2.6 发酵培养基组分对重组里氏木霉ZJ09产漆酶的影响
            3.2.6.1 碳源对产酶的影响
            3.2.6.2 氮源种类对产酶的影响
            3.2.6.3 铜离子浓度对产酶的影响
        3.2.7 重组里氏木霉ZJ09液体发酵产漆酶的条件优化
        3.2.8 分批补料发酵方法
        3.2.9 重组里氏木霉ZJ09所产漆酶的酶学性质研究
            3.2.9.1 温度对重组漆酶活性的影响
            3.2.9.2 重组漆酶的热稳定性研究
            3.2.9.3 pH对重组漆酶活性的影响
            3.2.9.4 重组漆酶的pH稳定性研究
            3.2.9.5 金属离子对重组漆酶活力的影响
            3.2.9.6 有机溶剂对重组漆酶活力的影响
            3.2.9.7 重组漆酶的动力学常数测定
        3.2.10 测定方法
            3.2.10.1 漆酶活力的测定
            3.2.10.2 还原糖含量的测定
            3.2.10.3 菌体生物量的测定
        3.2.11 数据处理
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 发酵培养基组分对里氏木霉ZJ09产漆酶的影响
            3.3.1.1 不同可溶性碳源对重组里氏木霉ZJ09产漆酶的影响
            3.3.1.2 不同氮源对重组里氏木霉ZJ09产漆酶的影响
            3.3.1.3 铜离子浓度对重组里氏木霉ZJ09产漆酶的影响
        3.3.2 重组里氏木霉ZJ09摇瓶条件下液体发酵产漆酶的条件优化
            3.3.2.1 发酵温度
            3.3.2.2 发酵液初始pH
            3.3.2.3 接种量
        3.3.3 重组里氏木霉ZJ09产漆酶的时间进程
        3.3.4 补料培养的产酶进程
        3.3.5 重组漆酶酶学性质的研究
            3.3.5.1 温度对重组漆酶活力的影响
            3.3.5.2 重组漆酶的热稳定性
            3.3.5.3 pH对重组漆酶活力的影响
            3.3.5.4 重组漆酶的pH稳定性
            3.3.5.5 金属离子对重组漆酶活力的影响
            3.3.5.6 有机溶剂对重组漆酶活力的影响
            3.3.5.7 重组漆酶的动力学常数测定
    3.4 本章小结
第四章 利用重组里氏木霉高效降解秸秆的研究
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 菌株
        4.2.2 试剂
            4.2.2.1 葡萄糖标准溶液
            4.2.2.2 中性洗涤液
            4.2.2.3 蒽酮溶液
        4.2.3 实验仪器及设备
        4.2.4 甘蔗渣和稻草秸秆的氨水预处理
        4.2.5 培养基
        4.2.6 重组转化子ZJ09固态发酵实验
        4.2.7 测定方法
            4.2.7.1 粗酶液的制备
            4.2.7.2 漆酶活力的测定
            4.2.7.3 还原糖含量的测定
            4.2.7.4 滤纸酶活力的测定
            4.2.7.5 木聚糖酶活力的测定
            4.2.7.6 稻草和甘蔗渣总失重及纤维素、半纤维素和木质素含量的测定
        4.2.8 数据处理
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 重组里氏木霉以秸秆为主要原料的固态发酵研究
            4.3.1.1 培养温度的影响
            4.3.1.2 培养基初始pH的影响
            4.3.1.3 基质含水量的影响
            4.3.1.4 接种量的影响
            4.3.1.5 氨水预处理的影响
            4.3.1.6 麸皮的加入对于产酶的影响
            4.3.1.7 原始里氏木霉ZU02和重组里氏木霉ZJ09的固态发酵产酶结果
            4.3.1.8 原始里氏木霉和重组里氏木霉对原料的降解
    4.4 本章小结
第五章 重组漆酶在环境污染物治理上的应用
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 漆酶
        5.2.2 试剂
            5.2.2.1 染料母液
            5.2.2.2 介体溶液
            5.2.2.3 内分泌干扰物母液
        5.2.3 实验仪器及设备
        5.2.4 染料脱色实验
            5.2.4.1 重组漆酶对弱酸性紫N-FBL的脱色实验
            5.2.4.2 重组漆酶对活性艳蓝KN-R的脱色实验
            5.2.4.3 重组漆酶对苋菜红的脱色实验
        5.2.5 内分泌干扰物降解实验
            5.2.5.1 双酚A降解实验
            5.2.5.2 三氯生降解实验
        5.2.6 测定方法
            5.2.6.1 漆酶活力的测定
            5.2.6.2 染料脱色率的测定
            5.2.6.3 内分泌干扰物降解率的测定
        5.2.7 数据处理
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 重组漆酶对弱酸性紫N-FBL的脱色
            5.3.1.1 漆酶用量对弱酸性紫N-FBL脱色影响
            5.3.1.2 pH对弱酸性紫N-FBL脱色反应的影响
            5.3.1.3 温度对弱酸性紫N-FBL脱色反应的影响
            5.3.1.4 金属离子及其浓度对弱酸性紫N-FBL脱色反应的影响
            5.3.1.5 漆酶对弱酸性紫N-FBL脱色反应进程
        5.3.2 重组漆酶对活性艳蓝KN-R的降解
        5.3.3 重组漆酶对苋菜红的脱色
            5.3.3.1 不同介体对苋菜红脱色的影响
            5.3.3.2 丁香醛浓度对苋菜红脱色的影响
            5.3.3.3 苋菜红脱色的时间进程
        5.3.4 重组漆酶对双酚A的降解
            5.3.4.1 不同介体对双酚A降解的影响
            5.3.4.2 双酚A降解的时间进程
        5.3.5 重组漆酶对三氯生的降解
    5.4 本章小结
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
    6.3 论文创新点
参考文献
作者简历
攻读博士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]里氏木霉VPS13基因缺失对菌丝分支、生孢和纤维素酶产量的影响[J]. 刘瑞艳,侯运华,王逸凡,钱远超,钟耀华.  微生物学报. 2017(10)
[2]里氏木霉QM9414尿嘧啶缺陷型转化体系改进和β-葡萄糖苷酶的过量表达[J]. 钟立霞,钱远超,戴美学,钟耀华.  化工学报. 2016(06)
[3]大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化[J]. 代军.  江苏农业科学. 2015(04)
[4]不同微生物菌剂对芒萁秸秆腐熟过程中腐殖质构成的影响[J]. 李国平,杨鹭生,王宇晴,赵林艳,汤婉君.  热带作物学报. 2015(04)
[5]磁性Fe3O4/石墨烯异质结固定漆酶特性及其对水中双酚A的降解研究[J]. 欧阳科,谢珊,赵雅,王雷超,方琪惠.  生态环境学报. 2015(01)
[6]里氏木霉RutC30常温常压等离子体（ARTP）诱变筛选pyr4基因缺陷型菌株及转化系统的建立[J]. 安莉颖,易欣欣,秦丽娜,施思,陶勇,伍红,董志扬.  菌物学报. 2014(06)
[7]自带介质血红密孔菌NFZH-1的鉴定及其木质素降解特性（英文）[J]. 冯年捷,翟华敏,王传槐.  林产化学与工业. 2014(05)
[8]木质纤维素原料中漆酶天然介体的研究进展[J]. 邱卫华,陈洪章.  生物工程学报. 2014(05)
[9]漆酶对活性黑KN-B和直接大红染料的脱色性能[J]. 杨波,杜丹,孙也,汪旭明.  环境工程学报. 2013(12)
[10]响应面法优化水杨酸比色测定还原糖的研究[J]. 朱凯杰,陆国权,张迟.  中国粮油学报. 2013(08)

硕士论文
[1]漆酶基因lac1338的原核表达酶学性质及定向进化研究[D]. 冯娟.广东药学院 2015
[2]高温纤维素降解菌的筛选及其复合菌剂对秸秆降解效果的研究[D]. 王元明.南京农业大学 2013
[3]E.coli高效感受态细胞转化体系的建立及诱导型瞬时表达载体的构建[D]. 杨坤.西北农林科技大学 2010



本文编号：3192455